Цветочные DIP-трансформация льна (<em> Linum Usitatissimum</em>) Для создания трансгенных потомство с высоким трансформации Оценить

1. выращивания растений 6 недель до погружения, заполните 5 дюймовые горшки с почвой и посеять семена льна ¼ дюйма глубиной в почву (4 семян на горшок). Будьте уверены, чтобы укрепить почву над семенами. Поливают растения регулярно и поддерживать их в долгосрочной дневного света (14 ч света и 10 ч темноты). Проверьте растения регулярно первичных соцветия (кластеров органов цветов ''). Растения готовы к трансформации, когда видны почки и только формируется в соцветия (рис 1 и 2). Чтобы увидеть бутоны, срезать листья вокруг него, если это необходимо. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование лучшие цветочные этап имеет решающее значение и подробно описана в дискуссии. Используйте главное филиала завода для экспериментального лечения, как она производит больше цветов, чем боковых филиалах. Используйте боковые ветви либо в качестве контроля (не ближний свет) или для других экспериментальных процедур. Кроме того, использование основных и побочных ветвейже установка для экспериментальной обработки и использовать другое растение в качестве контроля или для других экспериментальных процедур. Используйте наклейки, чтобы отметить отдельных отраслей и отдельных цветов с указанием даты и вида лечения. 2. Клонирование и трансформация и Escherichia coli (кишечная палочка) клеток Клонирование фрагмента / интересующего гена в сайт множественного клонирования растений бинарного вектора, несущего Т-ДНК. Выполнение клонирования в одну стадию или две стадии. Непосредственно клонировать маленькие вставки в данном протоколе (~ 500 б.п.) на завод двоичного вектора. В этом протоколе, с помощью растений бинарный вектор (PRI909). В противном случае, использовать любые другие растительные бинарных векторов в подобной стратегии. Кроме того, клон большие вставки (≥6.5 Kb) в два этапа: сначала с использованием общего набора коммерческого клонирования (не конкретных станций), а затем субклонирования в бинарный вектор растений. Настройка Reac ПЦРции, чтобы усилить интерес ген. Дизайн праймеров с сайтами рестрикции на 5 'конце (в соответствии с сайт множественного клонирования растений бинарного вектора в использовании). Выполнение стандартной ПЦР с использованием геномной ДНК льна при следующих условиях велосипедных: начальный захват 24 ° С, а затем 2 мин при 94 ° С, с последующими 30 циклами по 98 ° С в течение 5 сек, 60 ° С в течение 15 сек, и 72 ° С в течение 2 мин. Выполнение конечная стадия удлинения при 72 ° С в течение 5 мин с последующим на неопределенный срок при 4 ° С. Отдельные продукты ПЦР на 1% Трис / Борат / ЭДТА (КЭ) агарозном геле, запустить гель при 100 V в течение 1 часа. Очистить продукты от геля и количественно с помощью NanoDrop. Настройка лигирования смесь клонировать ПЦР-продукт в коммерческом клонирующий вектор. Следуйте протокол производителя. Преобразование перевязки смесь в химически компетентную E. палочки клетки следующим образом. Добавить 2 мкл сшитой смеси в одном флаконе Ч.emically компетентный E. палочки клетки. Инкубируют на льду в течение 30 мин. Теплового шока клетки в течение 30 сек при 42 ° С (тепловой шок времени и температуры зависит от типа клеток, используемых). Инкубировать на льду и добавить 250 мкл РТ супер оптимального бульоне с катаболитной репрессии (SOC) среде. Закрывают пробирку и инкубируют в орбитальном шейкере при 200 оборотах в минуту при 37 ° С в течение одного часа. Распространение 10 – 50 мкл из каждой трансформации на LB пластины нагретого (предварительно нагретой при 37 ° C) + соответствующего селективного антибиотика (определить селективное антибиотик в зависимости от типа коммерческой клонирующий вектор используется). Планшеты инкубируют при 37 ° CO / N. Pick ~ 10 колоний для очистки мини преп плазмиды, с помощью коммерческого набора. Мини очистка подготовительной плазмиды, как правило, осуществляется следующим образом. ПРИМЕЧАНИЕ: Имена буфера являются специфическими для коммерческого набора используется, но их общие функции аналогичны. Привить отдельные колонии в 2- 5 мл LB среды, содержащей соответствующий антибиотик (селективный определяется в зависимости от типа коммерческой вектора, используемого). Инкубируют в течение примерно 8 ч при 37 ° С при интенсивном встряхивании (~ 300 оборотов в минуту). Сбора клеток центрифугированием при 6000 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют осадок в 250 мкл ресуспендирования буфера. Смешайте и вихрь полностью разогнать шарик. Лизировать бактериальные клетки путем добавления 250 мкл буфера для лизиса, тщательно перемешать путем обращения труб 4 – 6 раз. Нейтрализовать лизата в буфере нейтрализации и инвертировать 4 – 6 раз перемешать. Центрифуга в течение 10 мин при температуре ~ 17 900 мкг на настольной микроцентрифуге. Передача супернатанты из предыдущего шага в колонну спина. Центрифуга снова в ~ 17 900 мкг в течение 30 – 60 сек. Промыть колонку спина, добавив 0,75 мл моющего буфера и центрифуги для 30 – 60 сек. Откажитесь от проточных. Центрифуга в течение еще 1 мин до Ремове остаточного промывочного буфера. Поместите колонку отжима в чистом 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Для элюирования ДНК, добавить 50 мкл воды к центру каждого столбца. Дайте постоять в течение 1 мин, а центрифуги в течение 1 мин. 3. Анализ очищенной плазмиды на присутствие вставки Ограничение Дайджест: Установка ограничения дайджест, чтобы определить присутствие вставки расщеплением плазмиды рестриктазами, используемых для клонирования вставки. Типичный двойной ограничение переварить реакцию следующим образом: 1 мкг плазмидной, 1 мкл каждого ферментов рестрикции, 2 мкл 10х ограничение переварить буфера + 2 мкл BSA (если применимо), X мкл воды (в общей сложности 20 мкл) Осторожно перемешать и инкубировать при рекомендуемой температуре (в зависимости от одного фермента к другому). Анализ ограничение переварить реакции на 1% агарозном геле КЭ, работать на 100 V в течение 1 часа и искать отсева соответствующего размера. ПЦР-анализ: Настройка ПЦР с очищенной плазмиды, используя праймеры от коммерческого векторной области для усиления внутри вставки или стыке между вектором и вставкой. Общие праймеры M13 вперед и назад и T3 / T7 праймеров. В этом протоколе, используют следующие условия ПЦР велосипедные: начальный захват 24 ° С, а затем 2 мин при 94 ° С с последующим 18 циклов при 98 ° С в течение 5 сек, 60 ° С в течение 15 сек и 72 ° C в течение 2 мин. Выполнение конечная стадия удлинения при 72 ° С в течение 5 мин с последующим на неопределенный срок при 4 ° С. ПЦР продукты нагрузки на 1% агарозном геле КЭ и работать в течение 100 – 120 V в течение 1 часа. Секвенирование: Отправить Очищенную плазмидную к коммерческой установки для секвенирования для анализа и подтвердить присутствие вставки. После того, как правильный конструкция получается, использовать его для второй стадии клонирования (в растение бинарного вектора). ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2,3 – 3,3могут быть устранены, если клонирование завершено в одну стадию. 4. Клонирование в завод бинарный вектор (PRI909) и Е. палочка Трансформация Установка двойной ограничение переварить реакции линеаризовать растений бинарный вектор и изолировать ранее клонированный вставку с использованием тех же сайты рестрикции, которые были добавлены к праймеров (этап 2,2). Анализ рестрикции дайджестов помощью гель-электрофореза, работать на 100 В в течение 1 – 2 часов. Сокращение вставку и линеаризованной растений бинарный вектор из геля. Использование коммерческого набора для очистки продуктов гель. Обратитесь к руководству производителя. Настройка реакции лигирования для лигирования вставки в растение бинарный вектор. Вкладыш соотношение вектора зависит от размера вставки и растительного бинарного вектора. В этом протоколе LIS1 вставка была 6,5 кб и завод бинарный вектор был 9 кб. Таким образом, использовать 1: 2 вставку соотношение вектора. <li> Повторите шаги 2,4 – 3 для бактериальной трансформации, очистки плазмиды и анализа. После того, как правильно конструкция (вставка + завод бинарный вектор) получается, переходите к электропорации в шаге 5. 5. электропорации в Agrobacterium tumefaciens Электрические компетентных клеток Оттепель флакон Agrobacterium tumefaciens электрически компетентных клеток на льду. Добавить 1 нг бинарный вектор плазмиды ДНК с 20 мкл компетентных клеток, на льду и осторожно перемешать. Холод 0,1 см электропорации кюветы на льду. Передача компетентный смесь клеток / ДНК в электропорации кюветы, и нажмите, чтобы собрать смеси в нижней части. Поместите кювету в Электропоратор машины и импульса (напряжение и время условия зависят от размера кюветы и электропоратора используется). Добавить 1 мл SOC СМИ и передачи клеток в 15 мл пробирку. Выдержите в течение 1 ч при 28 – 30° С, встряхивая при 100 оборотах в минуту. Пластина 50 – 100 мкл клеток на LB-агар + соответствующего селективного антибиотика (в зависимости от растений бинарную плазмиду и штамм Agrobacterium, используемого в этом протоколе применения 50 мкг / мл канамицина и 100 мкг / мл стрептомицина.). Инкубируйте пластин до 48 ч при 28 – 30 ° C. Повторите шаг 2,5 для выбора колонии и очистки плазмид. Повторите шаг 3 для анализа плазмиды и проверить целостность вставки и Т-ДНК перед использованием конструкции для цветочно-погружением. Повторите шаг 3,2, используя несколько праймеров ПЦР на всей территории региона вставки и по регионам Т-ДНК и секвенирования, как в шаге 3.3. Примечание: В этом протоколе 4 различных праймеры по Т-ДНК и 10 праймеров по всей вставки. После того, как присутствие растений бинарную плазмиду в выбранной колонии Agrobacterium подтвердится, место клетки Iп 50% глицерина и хранят при -80 ° С. Магазин остальные колонии на пластине при 4 ° С, если они должны быть использованы в течение одной недели 7. 6. Цветочные окунания ПРИМЕЧАНИЕ: 2 дней до цветочно-погружением: Выращивают клетки Agrobacterium к стационарной фазы (OD 600 от 0,5 – 1 приемлемо) в LB + соответствующими антибиотиками в жидких средах. Примечание: Это то же самое, как антибиотик, на этапе 5,6, на основе растительного бинарного вектора и типа штамма Agrobacterium используется. Начало культуры с 1: 100 разбавлении насыщенного (5 мл) O / N культуры и расти в течение 24 – 48 ч при 28-30 ° С при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Культура должна достигли midlogarithmic фазу и, скорее всего будет приближаться или стационарной фазы 1. ОД примерно 0,8 OD (снова в пределах от 0,5 до 1, все приемлемо) 8. Сбор клетки центрифугированием при 5000 хг при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток в среде инфильтрации (5,0% сахарозы + 0,05 – 0,003% Silwet L-77). Для первого раунда погружения, используйте 0,05% Silwet-77. Для второго и третьего раундов, уменьшить концентрацию до 0,03% (подробно в обсуждение). Перейдите с шагом цветочно-погружением. Положите растение на бок и опустите только видимые почки в инфильтрации среды в течение 1-2 мин. Оставьте растение на своей стороне и покрыть ее полиэтиленовой пленкой, чтобы поддерживать высокую влажность воздуха в куполе (рис 3). На следующий день, поместите растение в вертикальном положении и поддерживать в нормальном режиме. Когда бутон становится все больше (как правило, примерно через 10 – 14 дней), повторите шаги 6,1 – 6,4. Сокращение времени погружения до 30 – 60 сек и Silwet-77 концентрации до 0,003%. Поддерживать растения нормально, пока их семена не созрели и готовы быть собраны (Рисунок 4). 7. Выбор Положительный Траnsformants с прямым ПЦР Сейте семена Т1 на почву, как в шаге 1.1. В качестве альтернативы, чтобы Мурашига и Скуга базальной солевую среду (MS среде) с добавлением 2,2 г среде МС + 4 г агара в 500 мл воды. Автоклав и вылить в маленьких горшках растений. Хранить в 4 ° C до использования. Сейте семена, размещая их на затвердевает MS среды. Держите при длительном дневном свете (14 ч света и 10 часов темноты). Семена прорастают в течение 4 – 6 дней (рисунок 5). Используйте одно семя из каждого цветка в качестве отправной точки. Если ни одного положительного Трансформант не получается, повторите этот шаг, выбрав другое семя, из цветка. ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование различных семян из тех же цветов, так как в некоторых случаях, не все семена из одного цветка будет преобразован. Выбор дополнительных семена из экспериментальных цветов иногда необходимо. Проверка на рассаду регулярно. Примерно 10 – 14 дней после появления всходов, когда правдаоставляет разработки, тестирования растения с прямым ПЦР. Подготовка экстракт листьев ДНК путем разрезания 2 – 3 листьев (5 – 10 мг в весе) от каждого саженца и поместить их в микроцентрифужных трубки. Добавить 180 мкл 50 мМ NaOH в каждую пробирку и инкубируют в течение 10 мин при 95 ° С. Нейтрализовать экстракта путем добавления 20 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0). Использование 1 мкл экстракта в непосредственной реакции ПЦР, с использованием праймеров, сконструированных по Т-ДНК или вставки (фиг.7), чтобы выбрать для положительных трансформантов. В этом протоколе, используют прямой ПЦР с начальным отсеке 24 ° С, а затем 2 мин при 98 ° С, с последующими 40 циклами из (98 & ​​deg; С в течение 10 сек, стадии отжига в течение 15 секунд, и стадией удлинения при 68 ° С). Выполнение конечная стадия удлинения при 68 ° С в течение 5 мин, после чего на неопределенный удержание при 4 ° С. (Обратитесь к Таблице 1 для получения подробной информации о праймеров, температуры отжига и времени для удлинения циклов). Определить положительные трансформантов и выращивать их до срока погашения. Если семена проращивают в среде МС, трансплантации в почву в крупный банк (Рисунок 5).