Una<em> Ex Vivo</em> Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

La degeneración de los axones es una causa importante de morbilidad que abarca varias condiciones neurológicas incluyendo neurotrauma, accidente cerebrovascular, enfermedades autoinmunes, y enfermedades neurodegenerativas. A diferencia del sistema nervioso periférico (PNS), el sistema nervioso central (SNC) axones tienen una capacidad limitada para regenerar una vez heridos debido tanto a las barreras intrínsecas y extrínsecas (es decir, moléculas inhibidoras del crecimiento axonal producido durante la formación de la cicatriz y liberado durante la degeneración de mielina) ^{1 -7.} Aunque varias de estas barreras se han explorado ampliamente, las intervenciones terapéuticas dirigidas a prevenir CNS degeneración axonal, promover la regeneración axonal robusta, y restaurar connectively funcional, siguen siendo limitados.

Los axones una vez separados de su soma someten a un proceso estereotipada de la degeneración conocida como degeneración walleriana que se caracteriza por hinchazón axonal, la formación de esferoides y eventual fragmentación (revisado en ^8). EnPor el contrario, el muñón proximal que permanece en continuidad con el soma de un axón periférico seccionado, forma una hinchazón en su extremo, muere de nuevo al nodo más cercano de Ranvier y, a continuación puede iniciar la formación del cono de crecimiento, un requisito previo vital necesaria para la regeneración axonal subsiguiente ^9-11. En contraste, las terminaciones axonales proximales de muchos axones centrales forman "endbulbs" característicos o bombillas de retracción, no se forman conos de crecimiento, y en lugar de retraer lejos del sitio de la lesión donde permanecen durante meses después de la lesión ^12-15. Además de la lesión axonal primaria, daño axonal / pérdida adicional también puede ocurrir a los axones que se salvaron en gran parte de la lesión inicial. Esta pérdida axonal retraso de los axones librado inicialmente se denomina degeneración axonal como secundario. Esta respuesta inherente de los axones del SNC a una lesión hace que la regeneración axonal funcional un objetivo aún más difícil de lograr en el cerebro y la médula espinal.

Aunque hallmarks de lesión axonal (por ejemplo, la formación de esferoides, bombillas de retracción) han sido bien caracterizados a partir de modelos experimentales de la degeneración axonal tejido post-mortem y, elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos dinámicos ha sido restringido. La mayoría de estos estudios se basó en observaciones de punto final estáticas que intrínsecamente no lograron capturar respuestas axonal individuales en el tiempo. Aunque aplicadas exógenamente trazadores axonal han sido útiles para dilucidar las respuestas axonal de secciones estáticas y durante imágenes en vivo, la disponibilidad de marcadores axonal codificados genéticamente ha mejorado en gran medida nuestra capacidad de visualizar los axones en tiempo real, utilizando microscopía de fluorescencia. De hecho, un informe seminal de Kerschensteiner y colegas proporcionan primera evidencia directa de la degeneración axonal y la regeneración in vivo utilizando ratones Thy1 GFP-S que codifican la proteína fluorescente verde en subconjuntos de neuronas que envían sus proyecciones en las columnas dorsales de la médulacable de ^16. Imágenes en vivo enfoques utilizando dos fotones microscopía de barrido láser (TPLSM) y genéticas etiquetado proteína fluorescente de células de interés continúa proporcionando evidencia directa y visión mecanicista en muchos diversos procesos dinámicos tales como la degeneración axonal, Ca ^{2 +} señalización, la regeneración axonal, la fisiología de los astrocitos, fisiología microglial, y la respuesta a la lesión ^17-25.

A diferencia de los axones, se sabe muy poco de las respuestas a la lesión de la mielina en tiempo real. La mielina es un componente vital de la sustancia blanca producida y mantenida por los oligodendrocitos en las células del sistema nervioso central y de Schwann en el SNP. La mielina aísla 99% de la superficie de los axones y de esta manera proporciona una alta resistencia, la cubierta protectora de baja capacitancia que soporta rápida y eficaz la propagación del impulso saltatoria, revisado recientemente por Buttimore et al., ^26. Para capturar la respuesta dinámica de la mielina a las lesiones usamos la solvatocrómico, lipófilocolorante fluorescente Nilo ²⁷ Red. Las propiedades solvatocrómico de este colorante vital permiten desplazamientos espectrales de su espectro de emisión que es dependiente del entorno físico-químico ^28,29. Estas propiedades son útiles para comprender mejor los mecanismos de lesión axomyelinic y pueden ser visualizados usando dicroicas adecuadamente seleccionados y filtros de emisión o resolverse mediante microscopía espectral ^27. Por ejemplo, el espectro de emisión del Rojo Nilo es desplazada al azul en entornos menos polares, ricas en lípidos tales como los encontrados en los adipocitos y la mielina del SNC normal (pico de emisión ~ 580-590 nm) ^27. En contraste, los picos del espectro de emisión de este colorante vital en ~ 625 nm en endbulbs formados como axones sufren muerte regresiva axonal ^27. Aunque los mecanismos exactos que subyacen a estos desplazamientos espectrales específicamente en endbulbs frente a la mielina normal, siguen sin estar claros, tales cambios espectrales pueden revelar alteraciones subyacentes en la acumulación de proteínas o desorganización que lleva ala exposición de sitios de unión hidrófobos ^27.

Mientras imágenes in vivo es la métrica final para la observación de la dinámica de la médula espinal de lesión axonal en su entorno nativo, es técnicamente difícil y requiere experiencia quirúrgica considerable y, a menudo repetir cirugías para exponer la columna dorsal que puede introducir artefactos experimentales (por ejemplo, la inflamación y la cicatriz formación). Además, un equipo costoso es a menudo necesaria para permitir la suspensión y posicionamiento de un animal intacto bajo la lente del objetivo de microscopio. Los animales deben ser supervisados ​​cuidadosamente, así como asegurar que se mantienen cálidas, para garantizar los líquidos se reponen, y para garantizar que no haya signos de hipoxia debido a las sesiones de formación de imágenes anestesiados prolongados. Esto último es muy importante como axones y mielina absolutamente requieren perfusión constante y los niveles de oxígeno adecuados para seguir siendo viable. Sin embargo, esto a menudo no se informó ni controlado en la mayoría de los estudios in vivo afecha. Además, los artefactos de movimiento debido a la frecuencia cardíaca y la respiración (isoflurano anestesiados ratón adulto: ~ 300 a 450 latidos por minuto (BPM) es óptima para mantener la saturación de oxígeno 97 a 98% (normal tasa de ~ 632 BPM) y ~ 55-65 respiraciones por minuto (tarifa normal es de ~ 163 respiraciones por minuto), respectivamente)) ³⁰ encontrados durante in vivo de la médula espinal make imágenes diferenciar respuestas lesión axonal primaria y secundaria mediante microscopía de fluorescencia de alta resolución desafiante ya que incluso los más rápidos escaneos láser inevitablemente están sujetos a estos movimientos artefactos. Los avances en los escáneres de resonancia ultrarrápidos combinados con un vertebral rígida ventana enmarcada implantable puede permitir imágenes de la médula espinal murino en animales despiertos, pero los tiempos de exploración más rápido reducen inevitablemente la relación señal a ruido de calidad de imagen degradante. Otras mejoras en las técnicas de imagen de la médula espinal se utilizan en la actualidad para las imágenes cerebrales pueden superar muchos de estos obstáculos y limitar posibles confusiones introducidas por inala perfusión tisular dequate, por ejemplo, ^31-33.

Mucho de lo que se conoce sobre blanco fisiología y mecanismos de la lesión de la sustancia blanca cuestión se ha determinado utilizando in vitro o preparados ex vivo de la sustancia blanca del nervio óptico, el nervio periférico, y tiras de la médula espinal de la sustancia blanca ^34-41. Estas preparaciones continúan avanzar en el conocimiento de los mecanismos de lesión de la sustancia blanca, ya que permiten cambios en los factores ambientales, la aplicación controlada de fármacos y reactivos, evaluaciones funcionales utilizando electrofisiología, y observaciones de microscopía de fluorescencia directa de los axones y mielina en el tejido vivo controlados. Sin embargo, algunos de los enfoques anteriores para observar los axones de las tiras de la columna dorsal de la médula espinal o las tiras de materia blanca ventral inevitablemente dañar los axones superficiales durante la etapa de eliminación que pueden influir en la respuesta de los axones de cerca opuestos. Para sacar provecho de las manipulaciones experimentales anteriores y evitar daños en el cincofibras ry bajo investigación, utilizamos un modelo de la médula espinal cervical ex vivo, ya que evita el contacto directo de la cara dorsal de la médula. Por lo tanto, la arquitectura de la piamadre y axones columna dorsal superficial adyacentes permanecen viables e imperturbable durante el aislamiento.

Aquí se describe un enfoque relativamente simple que permite la visualización directa de los axones mielinizados centrales para que puedan responder dinámicamente a una lesión focal en tiempo real hasta 8 – 10+ horas después del daño. El modelo de lesión medular inducida por láser (Lisci) permite la diferenciación entre los mecanismos de lesión axonal primaria y secundaria como el (lugar de ablación) lesión primaria permanece espacialmente limitadas en el tiempo. La cámara de imágenes en baño abierto es accesible para la intervención terapéutica, la entrega de reactivos y manipulaciones ambientales. Agentes protectores axomyelinic putativos pueden ser evaluados rápidamente en tiempo real por observaciones directas frente a experimentos largos y costosos que implican proceso de tejidoing, seccionamiento, inmunotinción, captura de imágenes, y el análisis y por lo tanto proporciona un modelo sustituto útil para evaluar las respuestas agudas y manipulaciones de protección antes de probar los agentes experimentales en animales vivos.