النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em> في فيفو</em
Summary
We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
Abstract
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
Introduction
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء التجريبي وصفها هنا يسمح وضع العلامات الخلايا العصبية الحسية من الجهاز الشمي من اليرقات X. المورق بواسطة الصعق الكهربائي من dextrans يقترن fluorophore والتصور اللاحق للنمو محور عصبي حسي في الحيوانات الحية. من خلال تغيير معالم Electroporation للفي الجسم الحي من الممكن السيطرة على عدد الخلايا العصبية الحسية المسمى. وبالتالي فمن الممكن لتسمية مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية الحسية من الظهارة، وعدد قليل جدا أو حتى خلايا مفردة.
لضمان تمديد المطلوب لوضع العلامات العصبية من المهم توخي الحذر بشكل خاص حول خصائص ممص مكروى والبقول Electroporation لل. يمكن المقاومات ماصة أعلى والحد من الجهد نبض السعة والمدة وعدد من حالات التكرار تقلل من كمية الخلايا المسمى، في حين خفض المقاومة ماصة وارتفاع الجهد نبض السعة والمدة وعدد النبضات يمكن أن يؤدي إلى وضع العلامات أكثر انتشارا. عشراستخدام البريد من dextrans الفلورسنت ل electroporation يوفر ملاحظات مرئية فورية إذا كان تطبيق الإعدادات المناسبة. يجب الحرص على أن استخدام المعلمات لاتساع ومدة وعدد النبضات التي تتجاوز القيم المنصوص عليها في بروتوكول يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا أو حتى موت الخلايا 17. انسداد أو مكسورة نصائح من بال micropipettes يمكن أيضا أن تعيق Electroporation للنجاح.
في الجسم الحي Electroporation للفي الجهاز الشمي من X. المورق يقتصر على مراحل اليرقات منذ جلد الضفادع postmetamorphotic هو أكثر صرامة والتي لا يمكن اختراقها بسهولة مع ممص مكروى. التصور في الجسم الحي من العمليات العصبية يمكن أن يعوق تناثر الضوء الإثارة / الانبعاثات في المناطق الأكثر عمقا في الدماغ أو عن طريق الأوعية الدموية. تصبح هذه مشكلة واضحة خاصة في مراحل اليرقات أعلى بسبب الدماغ أكبر ويمكن أن يؤدي إلى إشارات صاخبة جعل تحديد واضح لعمليات محور عصبي غرامة أكثر صعوبة.
<pالطبقة = "jove_content"> تصاريح بروتوكول المعروضة لتصور الخلايا العصبية الحسية في نظام حاسة الشم سليمة دون تشريح الحيوان، وإتلاف الخلايا خلال وضع العلامات، وإعداد شرائح الأنسجة أو إصلاح الأنسجة عند الضرورة لطرق بديلة، مثل وضع العلامات في التصحيح خلية كاملة تجارب -clamp 18. عند الجمع بين العلامات القليلة احدة أو الخلايا العصبية الحسية في الجسم الحي مع مرور وقت التصوير، فمن الممكن تصور الاتصالات الكبيبي واحدة من الخلايا العصبية الحسية الناضجة على مدى فترات زمنية طويلة. بهذه الطريقة فإنه من الممكن أيضا لمراقبة تطور أنماط إسقاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية غير الناضجة على مدى عدة أسابيع. هذا الخيار الأخير هو اهتمام بوجه خاص لأنه يتيح مراقبة أنماط نمو محاور عصبية واحدة في الحيوانات الحية. هذا يفتح إمكانية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في توجيه محور عصبي والاستطلاعية. عدة عوامل، بما في ذلك مستقبلات الرائحة التعبير، ومختلف الذخائر المتروكةوقد تبين أن الجزيئات التوجيه ن والتي يسببها الرائحة / النشاط العفوي من الخلايا العصبية الحسية لتنظيم النتيجة المستهدفة من محاور الخلايا العصبية الحسية 4،5.ولا يقتصر تطبيق البروتوكول إلى الخلايا العصبية الحسية الشمية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أنواع الخلايا الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا الجذعية / السلف من المناطق العصبية من الدماغ النامي أو الخلايا التاجية من البصلة الشمية. بالإضافة إلى تقنية أثبتت ويمكن أيضا أن تستخدم في تركيبة مع dextrans الحساسة الكالسيوم أو حقن الأصباغ الكالسيوم غشاء منفذ للحصول على المعلومات الوظيفية حول الخلايا العصبية المسماة و / أو الدوائر المتصلة 7،19. توفر مجموعة واسعة من fluorophores إلى جانب dextrans يسمح وضع العلامات من الخلايا الفردية متعددة أو السكان مع ألوان مختلفة. البلازميد أيضا حل الحمض النووي، على سبيل المثال لترميز البروتينات الفلورية، هو مناسبة ل electroporation ويمكن زيادة تعزيز versatiliتاي وفائدة هذه التقنية 6. يمكن زيادة تعزيز بروتوكول للسماح للElectroporation للمجتمعة dextrans وDNA أو morpholinos تهمة التلاعب التعبير الجيني 13،17.
الطريقة الموصوفة يمثل بالتأكيد أداة جديدة للتحقيق في مجمع والعمليات لا تزال غير مفهومة تماما أن تنظيم التوجيه محور عصبي في النظام الشمي الفقاريات.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
| tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |
Referenzen
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo–from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis. , (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
