كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية
Summary
Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.
Abstract
نقدم لك هنا مجموعة من بروتوكولات الأبحاث اختبارها بدقة وقياسية جيدا تكييفها للاستخدام في البيئات البحرية البعيدة. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات وتقييم الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبية (الكربون العضوي المذاب، الجسيمات العضوية والمغذيات غير العضوية)، ووصف شامل للمجتمعات الفيروسية والبكتيرية (عبر التهم الفيروسية والجرثومية المباشرة، تعداد الميكروبات autofluorescent، و بناء metagenomes الفيروسي والجرثومي). نحن نستخدم مزيج من الأساليب، التي تمثل حقل مشتتة من التخصصات العلمية التي تضم بروتوكولات أنشئت بالفعل وبعض من أحدث التقنيات المتقدمة. تقنيات التسلسل خاصة ميتاجينومية تستخدم لالفيروسية والبكتيرية توصيف المجتمع، وقد أنشئت في السنوات الأخيرة فقط، وبالتالي لا يزال يخضع لتحسين مستمر. وقد أدى هذا إلى مجموعة متنوعة من CURREN إجراءات أخذ العينات وتجهيز العيناتTLY في الاستخدام. مجموعة من الأساليب المعروضة هنا يوفر ما يصل الى نهج موعد لجمع وتجهيز العينات البيئية. المعلمات تناولها مع هذه البروتوكولات تسفر الحد الأدنى على المعلومات الأساسية لتوصيف وفهم الآليات الكامنة وديناميكية المجتمع الفيروسية والجرثومية. أنه يعطي سهلة لمتابعة المبادئ التوجيهية لإجراء مسوحات شاملة ويناقش الخطوات الحاسمة والمحاذير المحتملة ذات الصلة إلى كل أسلوب.
Introduction
وتتعرض النظم الإيكولوجية البحرية لمجموعة واسعة من الاضطرابات التي تؤدي إلى تغييرات من توافر المغذيات إلى الكتلة الحيوية من الحيوانات المفترسة مهيمنة. على مدى العقد الماضي، وقد أثبتت دراسات متعددة على أهمية المجتمعات الميكروبية في النظم الإيكولوجية البحرية 1-4. فمن الواضح أن التغيرات في المجتمع البكتيري والفيروسي وترتبط بشكل وثيق مع التدهور العام للبيئة البحرية 5. قد تكون سهلت هذه التغييرات من قبل الجيوكيمياء تغير في عمود الماء مثل توافر الأكسجين أو إعادة التمعدن الكربون 6،7. نتيجة الترابط بين macroorganisms، كيمياء المياه والنشاط الميكروبي حلقات التغذية المرتدة يمكن تسريع وتيرة التدهور البيئي 8.
في 1970s و 80s جرت محاولات متعددة لكشف الدورات البيولوجية الكيميائية في النظم الإيكولوجية البحرية 9-11. كان واحدا من التحديات الرئيسية لهذه الدراسات في وقت مبكر لعدمنهج موحدة لقياس المعلمات البيوكيميائية تقييمها. وإن كانت هناك بروتوكولات المتاحة، في المقام الأول على المواد المغذية 12،13 مياه البحر، وتقييم ديناميات الكربون وبنية المجتمع الميكروبي كانت تقتصر من قبل على الأدوات والأساليب المتاحة. مع أساليب المقارنة JGOFS EqPac، وشارب وآخرون. 14 واقترح لأول مرة على بروتوكول موثوقة وموحدة لتقييم الكربون العضوي المذاب (DOC) التركيز. من قبل 2000s في وقت مبكر التحديات التحليلية لتحديد الموارد المتاحة للمجتمع الميكروبي وبالتالي قد تم حلها إلى حد كبير ونهج تميز المجتمعات الميكروبية في البيئات التي تسيطر عليها ثقافة أنشئت (انظر ديلونغ 15). تعتمد الطرق التقليدية التسلسل في ذلك الوقت إلى حد كبير على ثقافات نسيلي المزروعة. أوائل التسلسل الجيني للعينات البيئية الطبيعية كشف، مع ذلك، أن غالبية التنوع البيولوجي الميكروبي قد ضاعت من قبل النباتات المزروعةالأساليب القائمة على أوجه 16. في عام 2002، Breitbart وآخرون 17 بندقية تستخدم التسلسل لأول مرة لوصف المجتمع فيروسية في عينات مياه البحر البيئية تأسيس طريقة لتسلسل الجينوم الكامل للمجتمعات الفيروسية البحرية جاهل.
ضمن تقديرات الميكروبية الموجودة، والفيروسات لا تزال لا سيما في ظل مدروسة، حيث أن معظم من الصعب الثقافة وأنها تفتقر إلى علامة الحفظ عالميا مثل 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تستخدم عادة لتقييم التنوع والتنميط المجتمعي. يوفر نهج التسلسل ميتاجينومية بديلا للأساليب التي تعتمد على الثقافة واستهداف الجينات لتحليل المجتمعات الفيروسية المعقدة. بينما التسلسل أول metagenomes الفيروسية الناتجة عن مياه البحر باستخدام سانجر تسلسل 17، وقد أدى تطوير تقنيات التسلسل من الجيل التالي والتقنيات الجزيئية محسنة لزيادة سريعة في الدراسات ميتاجينومية 18 </sتصل>. سير العمل المختبر الحالي للmetagenomics الفيروسية ينطوي على الفصل، والإثراء، و / أو تركيز الجسيمات الفيروسية، تليها الحمض النووي (DNA أو RNA) استخراج وإعداد المكتبة، والتسلسل 19-21.
لمزيد من المعرفة القائمة على فيروسية، جرثومية وعمل الكيمياء الحيوية في النظم الإيكولوجية المائية، مقارنة مجموعات البيانات في الأنظمة المختلفة في جميع أنحاء العالم أمر ضروري. ومع ذلك، فقد تم تطويرها بشكل كبير على البروتوكولات التي أنشئت لالبيئات القريبة من الشاطئ مع مرافق المختبرات الوصول إليها بسهولة. وبالتالي، عدم وجود طرق موحدة الحقل يعرقل هذه المقارنات عبر النظام البيئي. هنا نقدم اختبرنا بدقة وموحدة جيدا التكيفات من الدولة من بروتوكولات الأبحاث الفنية للاستخدام في المواقع الميدانية النائية. وقد أثبتت هذه الأساليب الناجحة في دراسات متعددة تغطي العقد الماضي 5،22 وتستخدم حاليا من قبل مختلف المختبرات البحرية وكذلك على نواتقييم الشعاب المرجانية وبرنامج رصد (RAMP) في جميع أنحاء المحيط الهادي 4. وتشمل بروتوكولات أخذ العينات المعلمات المياه الكيمياء (تركيزات الكربون العضوية وغير العضوية، وتركيز المغذيات غير العضوية)، وفرة الفيروسية والجرثومية (بكتريا مباشرة، التهم الفيروسية مباشرة، والتدفق الخلوي لتقييم ذاتي التغذي مقابل نسب غيري التغذي)، والفيروسية والجرثومية بنية المجتمع و إمكانات التمثيل الغذائي من خلال تحليل ميتاجينومية (لمحة عامة انظر الشكل 1). يطلب من النتائج التي تم الحصول عليها من الأساليب المذكورة هنا من أجل توضيح معالم الخلفية البيولوجية الكيميائية الأساسية اللازمة لتوصيف شامل النظم الإيكولوجية المائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
سوف الأساليب المعروضة هنا يوفر أداة لتوليد تقييم شامل لديناميات الفيروسية والجرثومية في النظم الإيكولوجية المائية. انهم مستهدفون لقياس الأسهم يقف الموارد العضوية وغير العضوية المتاحة للمجتمعات الميكروبية وتميز ماكياج من الفيروسية والميكروبية حاضر المجتمع. بجانب قياس وفرة الفيروسية والجرثومية وفرة الكتلة الحيوية، المعلومات تسلسل الجينوم تكشف بنية مجتمعهم وظيفة. وقد وضعت جميع الطرق أو تعديلها للسماح للتطبيق في المواقع الميدانية النائية. ومع عدم وجود بيئة معملية تسيطر يخلق أصلا بعض الإمكانيات لأخطاء. نحن هنا نناقش بعض المحاذير المرتبطة بكل من المعلمات المقدرة. بجانب إمكانية التلوث أثناء التعامل مع العينة بعض المعلمات أيضا تسفر عن احتمال الخطأ في عملية التحليل.
الكربون العضوي المذاب
يمكن أن يحدث تلوث الكربون خلال إجراءات أخذ العينات (عينات المصب، أو على مقربة من قارب أو الغطاس)، خلال إعداد العينات (تلوث المعدات أو التعامل غير مقصود)، وحتى أثناء التخزين من عينة (عينات أخرى في الثلاجة تحتوي على العضوية المذيبات / المتطايرة). لتجنب مصادر التلوث المختلفة للسلوك كما بضع خطوات التعامل ممكن، كما نقل كل عينة يشكل مصدرا إضافيا للتلوث. يجب أن العينة لا تحصل على اتصال مع أي بند لا حمض غسلها أو حرقها. أخيرا، تعيين الفريزر التخزين حصرا للعينات لا تحتوي على المواد العضوية المتطايرة وضمان سلامة العينات خلال فترات التخزين الطويلة. إذا لا يمكن أن تبقى العينات المجمدة خلال الفترة تحمض السفر لفترات طويلة من عينات DOC مع حمض الهيدروكلوريك المركز (كما هو موضح 38-41) قد يكون بديلا للتطبيق. للتحقق من دقة قياس المواد المرجعية إجماع DOC ينبغي استخدام ريجularly خلال قياس DOC تشغيله. خصوصا المياه في أعماق البحار (> 2000 م) إشارات ذات قيمة في تقييم أداء الآلة التحليلية كما أنها مستقرة جدا في محتوى DOC في 42.
جسيمات المواد العضوية
بالإضافة إلى تجنب التلوث الكربون العضوي، وتتطلب أخذ العينات بوم اهتماما خاصا لضمان دقة من حجم المصفاة. وإذا كان حجم استهداف 500 مل يجب أن يخرج لأي سبب من الأسباب المحتملة هذا يحتاج إلى الإشارة إلى ربط كمية بوم القبض على مرشح لالراشح منها تم اشتقاق ذلك.
المغذيات غير العضوية
كما هو الحال مع أخذ عينات من الكربون العضوي، ويجب إيلاء الاهتمام لاحتمال تلوث العينة العناصر الغذائية المولدة من مصادر مختلفة مثل المراكب أو تصريف مياه الصرف الصحي (12). الفلاتر المستخدمة لأخذ عينات من الكربون العضوي مع أحجام المسام اسمية قدرها 0.8 ميكرون، قد لا تستثني كل الكتلة الحيوية الميكروبية وSHولد بالتالي تغييرها إلى 0.2 ميكرون مرشحات لهذه الخطوة الترشيح. وعلاوة على ذلك، وحدود الكشف تشكل مشكلة مع عينات المواد الغذائية؛ خاصة في المياه السطحية الشحيحة حول العديد من مواقع الشعاب المرجانية (على سبيل المثال، Cotner وآخرون. 43). حدود الكشف هي تقريبا حول 0.1، 0.2، و 0.1 ميكرومول / لتر لالامونيوم والنترات والنتريت، وأورثو فوسفات على التوالي (انظر 36،12،37)
المجهر
بجانب التغيرات في تركيز تحليل عينات الصور من الشرائح المجهر ينتج المزيد من احتمالات الأخطاء. على سبيل المثال، قد تكون الصور من التركيز في بعض المناطق في مجال الرؤية، والتركيز في مناطق أخرى. كما عالية النقاء الألومينا مرشح المصفوفة هو نوع فلتر جامد جدا، أي حطام تحت التصفية قد يسبب مرشح كله على الجلوس على زاوية إلى الشريحة. ونتيجة لذلك، يمكن للصور أن تكون دائما من التركيز في أجزاء مختلفة من مجال الرؤية لمرشح معين، وإعادةgardless المحاذاة المجهر. إعادة التنضيد والمرشحات، وضمان السفلي من مرشح نظيفة، ويمكن تحسين هذا إذا لوحظ. أيضا، في بعض الحالات قد يكون هناك اثنين من طائرات التنسيق فيها الفيروسات والميكروبات يمكن العثور عليه. هذا هو نتيجة لأشياء ملطخة تصبح بعيدة عن مرشح على تصاعد والعائمة تصل إلى الجانب السفلي من غطاء الانزلاق التي يمكن أن تجعل التهم لا يمكن الاعتماد عليها. لذا فمن المستحسن دائما للتحقق من نوعية العينات أثناء العملية.
التدفق الخلوي
كما هو الحال مع عينات مجهرية، قد تكون هناك اختلافات بين التدفق الخلوي العينات التي تتطلب تعديلات للعملية التحليلية التي تحدث بشكل طبيعي. على سبيل المثال، تبعا لحساسية الجهاز، قد تكون الاستشعاع خافت خلايا Prochlorococcus دون مستوى الضجيج ولن يكون كميا. حبات بمثابة عنصر تحكم عينة الداخلية (على سبيل المثال، للتأكد من أن التركيب الصكonse إلى إشارات الفلورسنت يتسق من يوم إلى يوم (ويبقى مستقرا خلال الفترة السابقة نفسها). إذا أضيفت إلى عينة بتركيزات معروفة، كما أنها يمكن أن تكون بمثابة الرقابة الداخلية للتحقق من المدى حجم العينة. ومع ذلك، فمن المستحسن لتشغيل دائما قسامة من المجمدة سابقا "القياسية" عينة مياه البحر التي تم إذابة والملون مع عينات من الاهتمام لتوفير المكافحة البيولوجية إضافية للتعامل بين أشواط لوحة 96-جيدا العينة. اعتمادا على الموقع، وعينات من مياه البحر قد تبدو مختلفة جدا عن بعضها البعض. يمكن فرز السكان "التمثيلي" ثم عرض تحت المجهر epifluorescent (EM) أن يكون وسيلة جيدة للتحقق بسرعة السكان العوالق النباتية إما Synechococcus س. أو حقيقيات النوى الضوئي. Prochlorococcus الخلايا عادة ما تكون غير مرئية تحت EM لأنها تتلاشى بسرعة كبيرة. بالإضافة إلى كلوروفيل أ، Synechococcus س. تحتوي أيضا على درجة الحموضةphycoeurythrin otopigment (PE)، والتي تنبعث الضوء بأطوال موجية أقصر (540-630 نانومتر) من الكلوروفيل أ (660-700 نانومتر). عندما متحمس خلايا Synechococcus مع الأزرق / الضوء الأخضر (470-490 نانومتر)، فإنها ستظهر الذهبي إذا ما نظر إليها في إطار تصفية الانبعاثات التي تزيل جميع الأطوال الموجية للضوء أقل من 510 نانومتر. وعلى سبيل المقارنة، فإن نسبة حقيقية النواة تبدو حمراء، عندما متحمس بنفس الطول الموجي للضوء.
Metagenomics الفيروسية
من المهم أن نلاحظ أن عملية تركيز فلب والتخزين تؤثر على المجتمع استردادها. يمكن أن يحدث فقدان الجسيمات الفيروسية في كل خطوة في هذه العملية، وبالتالي، فإن اختيار تنقية وتخصيب بروتوكولات الفيروسية يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف التكوين التصنيفي الملحوظ وتنوع metagenomes الفيروسي الناتجة 44،45،18. يمكن أن يتم تركيز العينات باستخدام TFF 19 أو الكيماوية التلبد 20. في هذا النهج، posit الكيماويةاتهم ively أيونات الحديد تربط الجزيئات الفيروسية بشكل طبيعي سالبة الشحنة تشكيل (> 8 ميكرون) مجمعات للحديد الفيروسية الكبيرة التي تلبد من الحل، ويمكن استردادها باستخدام مرشحات 8 ميكرون. بعد ذلك تم بالكلاب الحديد قبالة الجسيمات الفيروسية وإعادة حله باستخدام المغنيسيوم، وحامض الأسكوربيك، وEDTA، وترك الجزيئات الفيروسية المركزة لاستخراج الحمض النووي 20. بعد مقارنة هذه الطرق الحالية اثنين، استنتجنا أن طريقة كلوريد الحديد هو أقل استهلاكا للوقت من TFF تركيز الفيروسي، ولكن قد تنتج بعض المحاذير. وجدنا أن تفكك وانحلال الحديد للفيروسات يتطلب شقين أكثر تركيزا حل المغنيسيوم، حمض الاسكوربيك EDTA مما ذكر 20 من أجل حل بالمضي قدما قبل يحط حامض الاسكوربيك. وبصرف النظر عن هذه المسألة، وبروتوكول ينقي الجسيمات الفيروسية التي كتبها الحجم التجزئة وحدها، وإزالة الملوثات الميكروبية باستخدام 0.2 ميكرون الترشيح. الفيروسات الكبيرة لا تمر عبر FILTإيه (على سبيل المثال، يانغ وآخرون. 46) وبالتالي لن يتم الكشف في metagenome، في حين تفعل بعض البكتيريا (McDole، بيانات غير منشورة). هذا يؤدي إلى تلوث جرثومي في حين التمييز ضد الفيروسات الكبيرة.
إلا أن قضية محددة وثيقة الصلة أيضا لإزالة الميكروبات في اتصال مع تركيز TFF. كما ثبت أن العلاج الكلوروفورم لإزالة الفيروسات الحساسة الكلوروفورم مع الأغشية الدهنية الخارجية 47 تشير بعض الدراسات إلى أن 0.22 ميكرون الترشيح يمكن استخدامها لإزالة معظم البكتيريا. كما ينبغي الإشارة إلى أن طريقة عرض يستهدف في المقام الأول الجراثيم، الناقل الأكثر وفرة من المواد الوراثية في البيئات البحرية. لأن فج ويعتقد عموما لا يحتوي على الدهون عادة 48 أنها أكثر مقاومة للعلاج الكلوروفورم. على حد علمنا لا يوجد طريقة "اللحاق جميع" حتى الآن. الطريقة المعروضة هنا يتم تكييف من OUالخبرة الميدانية ص على مدى السنوات ال 10 الماضية في مختلف البيئات البحرية الاستوائية التي تمتد إلى نظم القطب الشمالي.
الميكروبية Metagenomics
بناء المكتبات ميتاجينومية عن الميكروبات (مثل البكتيريا والعتيقة) هو أكثر وضوحا من metagenomes الفيروسي كما أنه من الأسهل لتوليد تركيزات الحمض النووي الحد الأدنى المطلوب لإعداد مكتبة. رابط تضخيم بندقية مكتبات (LASLs) 17،49،50 وكله الجينوم التضخيم القائم على التضخيم متعددة التشريد (MDA) هما الأساليب الأكثر شيوعا لتوليد الحمض النووي الكافي لتسلسل. استخدام نجمة داود الحمراء في الحصول على الحمض النووي تركيزات أعلى في metagenomes الميكروبي ضروري في بعض الأحيان. ومع ذلك، يمكن أن يسبب هذا القطع الأثرية في تسلسل البيانات، مثل overamplification من minicircles دوامي السياط. ومن المعروف أن الأساليب MDA تفضيلي لتضخيم الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ودائرية، مما أدى إلى نتائج غير الكمية 51،52. الاقتراب من LASLs الأمثل وبالتالي قد 50 بمثابة بديل أفضل في تضخيم كل من الجراثيم والحمض النووي الفيروسي للميتاجينومية التسلسل. من المهم أن نلاحظ أن النهج LASLs له خطوات متعددة، ويتطلب معدات متطورة، ويقتصر على القوالب dsDNA. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أنسجة عدة استخراج الحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من كل من غرام وغرام إيجابي سلبي من الكائنات الحية، ولكن لم يتم التحقق منه لأصناف الجراثيم بشكل فعال المتمردة ليز أو الهياكل المرتبطة بها (على سبيل المثال، العتيقة معين، الأبواغ أو الجراثيم الفطرية) . بالتالي خطوة الضرب حبة قد يكون من الضروري الحصول على الحمض النووي من بعض الميكروبات.
وهذه التقييمات الشاملة يؤدي إلى فهم أفضل لعمل الفيروسية والجرثومية النظام البيئي. على الرغم من إجراء بعض الدراسات لتقييم جهود جميع المعلمات المقترحة، وكثير منها تم التحقيق مختارة. اقترح نيلسون وآخرون. 53 اتصال betwالتابعين موائل الشعاب محددة واستنفاد في كل من DOC والعوالق البكتيرية تركيزات النسبية إلى المياه البحرية. وقد رافق هذه التغييرات التركيز من قبل التفرقة مميزة للمجتمعات العوالق البكتيرية. Dinsdale وآخرون. 5 أظهرت أن زيادة التأثير البشري رافقه 10X فرة أعلى من الخلايا الميكروبية وجزيئات شبيهة بالفيروس. كانت المجتمعات الميكروبية في المياه البحرية المحيطة الجزر المأهولة أيضا حصصا متزايدة من heterotrophs ومسببات الأمراض المحتملة 5. أخيرا McDole وآخرون. 4 أظهرت، من خلال تقديم النتيجة microbialization، أن الأنشطة البشرية تتحول الطاقة إلى الميكروبات، على حساب من macrobes. هذه الدراسات ركزت على الجراثيم والكيمياء الماء معايير محددة، وتوفر رؤى جديدة في هيكل النظم الإيكولوجية البحرية والكيمياء الحيوية. الجمع بين البيانات التقليدية من جهود الرصد البيئي – مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة القيم، والكتلة الحيوية الأسماك وdiversiتاي، غطاء القاعية، أو التعرض لتأثير الإنسان – مع كيمياء المياه والتقييمات الميكروبية، سيؤدي على الأرجح في جهود الرصد البيئي أكثر حساسية، مما قد يؤدي إلى جهود المحافظة المستهدفة بشكل أكثر تحديدا.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32 – 36 % Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550° C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 l collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm polycarbonate Track-Etched Membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10 – 20 L) | |||
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25 % glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| 0.02 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg ml-1 | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic Acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide Station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg ml-1) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof 100% Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra – swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 u µl-1) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 100 % Ethanol (200-proof) | Electron Microscopy Science | 15058 | |
| 1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg ml-1 Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50ml Oak Ridge Tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
Referenzen
- Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399 (6736), 541-548 (1999).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318 (5847), 97-100 (2007).
- McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7 (9), (2012).
- Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3 (2), (2008).
- Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7 (5), 962-979 (2013).
- Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
- Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9 (7), 835-845 (2006).
- Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52 (6), 1571-1584 (1988).
- Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33 (4), 725-749 (1988).
- Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41 (11), 1565-1574 (1977).
- Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. , (1976).
- Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
- Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48 (2), 91-108 (1995).
- DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5 (5), 520-524 (2002).
- Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180 (18), 4765-4774 (1998).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
- Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
- Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6 (3), 638-649 (2012).
- Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
- Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51 (3), 201-213 (1989).
- Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145 (1), 269-277 (1996).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48 (4), 1457-1465 (2003).
- Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53 (6), 1090-1100 (2008).
- Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2 (9), 924-936 (2008).
- Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4 (11), (2006).
- Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263 (266), (1998).
- Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57 (16), 1433-1445 (2010).
- Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19 (6), 984-989 (1974).
- Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
- Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389 (1), 53-60 (2010).
- Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45 (6), 1213-1223 (2000).
- Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
- Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24 (1), 17-26 (2001).
- De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52 (6), 2608-2617 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43 (3), 375-386 (1998).
- Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23 (5), 611-620 (2000).
- Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (1), 4547-4553 (2011).
- Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18 (6), 709-712 (2006).
- Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 736-738 (1961).
- Ackermann, H. W., Calendar, R. . The Bacteriophages., Second Edition. , 8-16 (2006).
- Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5 (2), (2010).
- Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
- Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
- Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
- Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5 (8), 1374-1387 (2011).
- Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10227-10232 (2014).
- Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. , (2014).
