Инфильтрации центрифугирования Техника для извлечения апопластической Жидкость из листьев растений, используя<em> Phaseolus обыкновенная</em> Как пример
Summary
This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Abstract
Апопласт это то, внеклеточного компартмента в растительных тканей, что лежит вне плазматической мембране и включает клеточную стенку. Апопластической отделение листьев растений является местом нескольких важных биологических процессов, в том числе формирования клеточной стенки, клеточной питательных веществ и поглощения воды и экспорта, завод-эндофита взаимодействий и обороны ответов на патогены. Способ инфильтрации-центрифугирования хорошо известна в качестве надежного метода для анализа растворимого апопласта состава различных видов растений. Жидкость, полученный этим способом, обычно известный как апопласт промывочной жидкости (АВФ). Следующий протокол описывает оптимизированный для вакуумной пропитки и центрифугирования метод для извлечения AWF от Phaseolus обыкновенный (фасоли) сорта. Tendergreen листья. Обсуждаются ограничения этого метода и оптимизации протокола для других видов растений. Восстановленные АВФ могут быть использованы в широком диапазоне ниже по течению экспериментальTS, которые стремятся охарактеризовать состав апопласт и как она изменяется в зависимости от вида растения и генотипа, развития растений и условий окружающей среды, или определить, как микроорганизмы растут в апопласта жидкости и реагировать на изменения в ее составе.
Introduction
Растение апопласт является межклеточное пространство, которое окружает клетки растений. Это динамичная среда, в которой многие метаболические и транспортные процессы. Основным структурным компонентом апопласт является клеточная стенка, который собран и модифицированы ферментов, структурных белков и метаболитов, расположенных в апопласт. В здоровых клетках растений апопласт как правило, поддерживается в кислой государство, допускающее аминокислоты, сахара и другие питательные вещества, чтобы быть импортированы из апопласт в цитоплазму Н + symport 1. Во транспорта сахарозы, сахароза переходит от фотосинтезирующих источников через апопласт и в флоэмы сосудистой; сахароза транспортируется с помощью осмотического потенциала поддерживается апопластической инвертазы, расщепляющих сахарозу в органах раковина 2. Сахар и другие питательные вещества, также можно транспортировать вверх и накапливаются в устьичные полости через поток транспирации 3.
"> Апопласт также представляет собой экологическую нишу, где многие болезнетворные микроорганизмы установить их паразитического существования. Бактериальные патогены растений обладают способностью размножаться до высоких плотностей в апопласт, которые они доступ через естественные отверстия, такие как устьица или через раны 4. Концентрация амино кислоты и другие соединения азота в томатном апопласт, как было показано, чтобы быть достаточным для поддержания потребностей в питании бактериальных и грибковых патогенов 5,6. Первичные защитные реакции, направленные патогенных микроорганизмов также может возникать в апопласт, а именно производство активных форм кислорода внеклеточных пероксидаз . и оксидазы и укрепление клеточной стенке, через сшивки и каллозы осаждения 7 клеточной стенки растений богат вторичных метаболитов с антимикробными деятельности; биохимический характер этих вторичных метаболитов зависит от вида 8.В результате описанного выше-упоминанииред и другие процессы, лист апопластической жидкости содержит множество белков, сахаров, органических кислот, аминокислот, вторичных метаболитов, металлов и других катионов (например, Mg 2+, К +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Концентрации растворенного вещества в апопласт побегов контролируется в основном за счет баланса транспортных процессов, происходящих между апопласт и ксилемы, флоэмы и цитоплазмы 9. Однако, метаболические реакции и рост микробов потребляют или производят апопластической растворенные вещества. Состав апопласт, как известно, отличаются между видами и генотипами растений и в ответ на изменение условий окружающей среды, включая света, питания и биотических и абиотических стрессов 9. При изучении состава апопласт и как он меняется, в том числе свойств, таких как окислительно-восстановительного потенциала и осмотического потенциала, рН, питательных веществ / наличии метаболита и ферментативных активностей, можно получить новые понимание того, как растения повторноствуют их среде. Понимание или характеризующие молекулярные изменения, которые происходят в апопласт раствора осложняется тем, что она является пространственно структурированный и динамический отсека, в котором метаболиты и / или ионы могут быть летучими, временной или связаны с клеточной стенкой и плазматической мембраны. Кроме того, различные аналитические методы, необходимые, чтобы охватить весь диапазон различных химических типов.
Для изучения состава растворимой апопласт, жидкости, как правило, должно быть извлечены из ткани. Существуют несколько способов извлечения апопласт жидкости из различных тканей, в том числе недавно предложенном методе фильтра полосы 10, но наиболее признанным методом экстракции для листьев инфильтрации-центрифугирования. Эта техника была оценена ранее 11-13 и Lohaus и др., 2001 14 обеспечивают тщательное обследование многих технических параметров метода. Как следует из названия, инфильтрации centrifuдование техника двухступенчатый способ, который, по существу включает в себя замену апопластической воздушного пространства с водной инфильтрации жидкости, которая смешивается с нативной апопластической жидкости, с последующим восстановлением инфильтрации / апопластической жидкой смеси, осторожно центрифугирования листьев. Как извлекают жидкость разбавляли и не содержит всех соединений, присутствующих в апопласт (смотри ниже), эта жидкость, обычно известный как апопласт промывочной жидкости (АВФ), или иногда межклеточной промывочной жидкости, а не апопластической жидкости. Методика инфильтрации-центрифугирование позволяет легко масштабировать один или объединенные образцы АВФ адекватного объема, чтобы быть получены и подвергнуты широком диапазоне ниже по течению биохимических и аналитических методов (например, электрофореза белков, измерение активности фермента, ЯМР, многие виды хроматографии и масс- спектрометрии). Лист AWF также полезен в качестве апопласт подражая питательную среду для изучения взаимодействия растений колонизации микробов именноч окружающей их среды 5.
В следующих протоколов мы опишем, как выполнять технику инфильтрации центрифугирования с использованием Phaseolus обыкновенная резюме. Tendergreen листья, и привести несколько примеров ниже по течению анализов с акцентом на метаболомике. Важно отметить, что методы оценки качества AWF предоставляются вместе с советом оптимизировать процедуру для различных типов листьев.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимизация источник растительной ткани
Биологических и технических вариация может быть большим при выполнении апопласта экстракции, таким образом, максимально стандартизированные рабочий процесс полезным для повышения непрерывности через экспериментах (рис 1). Важно отметить, что источником растительной ткани должны быть стандартизированы, в том числе типа листа, листа возраста, роста / условий окружающей среды и времени суток (таблица 1). Существуют значительные различия в той легкости, с которой различные листья проникли и AWF впоследствии центрифугированием; эти различия коррелируют с устьиц количество, размер диафрагмы и мезофилла сопротивления 12,14. Даже среди различных сортов Р. обыкновенная существуют большие различия в легкости и выход процедуры экстракции AWF; например, листьев различных Tendergreen, используемые здесь, более склонны к добыче AWF, используя этот метод, чем канадской Wonder сорта. ВП. обыкновенная первые настоящие листья большой и самый простой, чтобы проникнуть, что делает их очевидным выбором для апопластической экстракции. Апопластической воздуха и воды объем было показано, меняются в зависимости от возраста листьев у некоторых видов, ведущих к различиям в AWF экстрагируемости 12,14. У P. обыкновенная, старые листья становятся значительно более сложно проникнуть и дают меньше AWF на центрифугирования; Поэтому листья собирают, когда они достигли полного расширения. Листья, которые трудно проникнуть в дальнейшем потребовать более высокие скорости центрифугирования для восстановления AWF. Поэтому следует тщательно просеивать несколько различных типов листьев и сорта, прежде чем решить на источник ткани для крупномасштабных Ауф экстракции.
Условия роста растений также должны быть стандартизированы, насколько это возможно в рамках эксперимента. Использование шкафов роста является предпочтительным, поскольку они позволяют последовательно влажность, температура и светодиодныеполки интенсивности т должны быть сохранены. Сбор листьев всегда должны происходить в то же время суток, так как концентрации метаболитов, ферментов и т.д. меняться в течение суточного цикла 14. Наконец, для того, чтобы листья растений все имеют аналогичный давление тургора растения поливают незадолго до (~ 1 ч) урожая.
Оптимизация листьев инфильтрации и центрифугирования
Нежелательный цитоплазматический загрязнение ФАЖ из-за частичного лизиса клеток приведет если механическое напряжение, с которыми сталкиваются клеток является слишком высокой в ходе инфильтрации или центрифугированием шагов. Таким образом, процедура для данного типа листа должна быть оптимизирована компромисс между максимизацией доходности и минимизации цитоплазмы загрязнения AWF. Во всех других случаях, следует использовать самую низкую скорость центрифугирования, при котором AWF могут быть восстановлены, чтобы избежать возможного механическим разрушением клеток листьев. Оптимизация centrifuСкорость дование должны быть определены эмпирически для каждого типа листа путем мониторинга объем извлеченного и апопласта загрязнения в диапазоне скоростей центрифугирования. Было обнаружено, что маркер активности ферментов, таких как MDH, G6PDH и глюкозо-изомеразы фосфата, не остается на низком уровне до порогового центробежной силы превосходили, выше которого эти действия быстро увеличиваться, предположительно из-за утечки цитоплазматической 9,12,14. Использование парафильмом для поддержки во время стадии центрифугирования, как было отмечено Бейкер и др. 2012 11, может улучшить эффективность экстракции AWF и может свести к минимуму механическое повреждение листовой пластинки, вызванного чрезмерного сгибания и сжатия. Кроме того, использование парафильмом улучшает визуализацию листа после центрифугирования, когда необходимо исследовать лист за ущерб и полноты извлечения AWF.
Nouchi 12 описывают оптимизацию восстановления AWF из резаного риса отрезкам листьев, которые difficult проникнуть и требуют более высоких скоростей центрифугирования для сбора AWF из-за их малых устьиц отверстия. Улучшение смачивания рисовой листовой поверхности, либо для предварительного замачивания листья в дистиллированной воде или добавление поверхностно-активного вещества к инфильтрации жидкости, способствует процессу инфильтрации. Высокая скорость центрифугирования (6000 мкг) был также использован во время контроля на апопластической загрязнения 12. При использовании вырезать лист разделы всегда есть риск того, что цитоплазматическая загрязнение будет более распространенным, даже с большим мытья раневых участков; Поэтому срезанные листья следует использовать, когда необходимо лишь.
Для многих исследований дистиллированную воду используют в качестве инфильтрации жидкости 11. Тем не менее, соединения могут быть добавлены к инфильтрации жидкости, такие как соли или буферы, чтобы улучшить извлечение некоторых апопластической соединений, особенно белков 13. Lohaus 14 оценивали влияние ионной и осмотического силы он состав восстановленного AWF и найти их будет незначительным. Изменение рН среды инфильтрации, однако, может влиять на состав AWF 14.
Правильное обращение и хранение добытого апопластической жидкости имеет важное значение. АВФ было показано, содержат обилие протеаз и других ферментов 13,20, а также летучие органические соединения. Поэтому, чтобы уменьшить изменения в составе ФАЖ после восстановления и рекомендуется, чтобы образцы на льду или иным образом хранили при -80 ° С. Кроме того, ферментативные анализы ФАЖ должна быть выполнена как можно скорее после экстракции, чтобы ограничить инактивацию фермента за счет протеолиза длительного разведения или замораживания-оттаивания.
Процесс инфильтрации разбавляет апопластической жидкость, и это часто бывает необходимо определить степень этого раствора. Шаг центрифугирования может также разбавить водой AWF из внутриклеточных компартментах. Коэффициент разведения необходиморед оценить прижизненно апопласта химические концентрации, когда измерения производятся на AWF. Коэффициент разбавления необходимо также, чтобы сконцентрироваться AWF обратно в полную силу, когда он используется в качестве апопласт подражая питательную среду для микробов – тем самым отражая в естественных условиях концентраций метаболитов настолько точно, насколько это возможно. Существует несколько вариантов по методу, описанному на этапе 4 для определения коэффициента разбавления AWF путем измерения разбавления маркера соединения добавляют к инфильтрации жидкости. Для всех методов расчета разбавления AWF предполагает, что инфильтрация жидкость не заметно поглощается или разбавлены клетках листьев во время процесса восстановления AWF. Это предположение было ранее проверены на инфильтрации 14, но непроверенные на стадии центрифугирования. Соединение маркер должен также не быть поглощенным, транспортировать или изменения, а в апопласт. Индигокармин является наиболее широко используемым и тщательно протестированы красителей, используемыхдля расчетов разбавления Ауф. Индигокармин проявляет низкую абсорбцию катионообменной смолы и изолированных клеточных стенок и было показано, что подходит для расчетов Ауф в Brassica париз, Pisum посевного, Solanum Lycopersicum и глицин макс 11,21,22. Тем не менее, в некоторых видах лист, например, риса и огурцов, индиго кармин, казалось, не полностью восстановился после инфильтрации, что может привести к недооценке фактора разбавления AWF 12,21. Отсутствие восстановления индигокармина может быть связано с его восприимчивостью к расщеплению в изатина сульфоната с супероксид 23, который, как известно, получают в апопласт, особенно в условиях стресса 24. Расщепление индигокармина в изатина сульфонат приведет к потере поглощени при 610 нм и увеличение на 245 нм. Если эта реакция происходит в значительной степени в апопласт, или же эта реакция может быть подавлено добавлением поглотителей, чтобы супероксидных инфильтратионная жидкость не была исследована на сегодняшний день. Голубой декстран был использован вместо индигокармина для количественного определения фактора разбавления AWF в рисе выходит 12, хотя его стабильность и восстановление ФАЖ не сообщалось. Кроме того, меченые соединения, такие как [14 C] сорбит или другие измеримые внутренних стандартов может быть использован вместо красителей и снижения радиоактивности или концентрации измеряются и используются для расчета коэффициента разбавления аналогичным образом 11,14,25.
Ограничения метода
Существует несколько предостережений для метода изоляции AWF инфильтрации центрифугирования. Во-первых, разбавление апопласт течение инфильтрации может вызвать ответ от завода. Если окружающие клеток листьев обнаружить уменьшенный концентрации для некоторых компонентов апопластической жидкости, они могут реагировать на выделывать дальнейшие метаболитов, искажая трактовку концентрации метаболитов. Воценка этой проблемы было отмечено, что ни времени между инфильтрации и центрифугирования, ни умеренных различий в ионной силе инфильтрации жидкости влияет на состав добываемого ФАЖ 14,22. Таким образом, любые артефакты, возникающие в результате апопласт разведение, как думают, будет минимальным.
Вторым потенциальным недостатком является то, что элюирование ФАЖ центрифугированием не захватывает все молекулы, присутствующие в апопласт по нескольким причинам. Некоторые соединения, в частности катионов и белков может быть жестко связаны с отрицательно заряженной клеточной стенки и не элюируют с ФАЖ 13. Другие молекулы, такие как белки, может быть слишком большим, чтобы эффективно элюировать из апопласта на скоростях центрифугирования, используемых 14. Активные формы кислорода важный класс соединения, полученного в апопласт, но из-за недолгой природы этих соединений, и неуточненные требования для их производства, их PResence не очень хорошо захвачен добычи AWF. Не известно, как точно АВФ представляет композицию в естественных условиях апопласт жидкости, и это может варьироваться в зависимости от вида.
Несколько анализы существуют, чтобы определить, цитоплазматический загрязнения, хотя никто не являются общепринятыми. Анализы преимущественно цитоплазматических ферментов (например, G6PDH, гексозы фосфат изомеразы, MDH) имеют преимущество, что его легко выполнить, но не могут хорошо коррелируют с цитоплазматической утечки 14,18. Оценка цитоплазматических метаболитов (например, гексозы фосфаты, хлорофилл), пожалуй, более показательным, но менее четко установлена 11. Тем не менее, любой тип анализа может быть полезным для количественной оценки относительной апопластической загрязнения между образцами. В идеале, несколько независимых измерений должны быть использованы для проверки целостности образца AWF.
Признавая свои ограничения, инфильтрации centrifugatiна методике, описанной здесь, остается простой и надежной техники при изучении апопластической белков, первичных и вторичных метаболитов и неорганических ионов.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
Referenzen
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
