공장에서 유체 Apoplastic의 추출을위한 침투-원심 분리 기술을 사용하여 잎<em> 위 Phaseolus 심상</em> 예를 들어
Summary
This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.
Abstract
apoplast은 세포막과 외측에있는 칸막이 벽을 포함 식물 조직의 세포 외 구획 별개이다. 잎 식물의 apoplastic 구획은 세포벽 형성, 세포 영양 및 수분 흡수 및 수출, 식물 내생 상호 작용과 병원균에 대한 방어 반응 등 여러 가지 중요한 생물학적 과정의 사이트입니다. 침투 원심 분리 방법은 물론 다양한 식물 종의 수용성 apoplast 조성물의 분석을위한 강력한 기술로서 확립된다. 이 방법에 의해 얻어진 액은 일반적 apoplast 세척액 (AWF)로 알려져있다. 다음 프로토콜은 위 Phaseolus 심상 (프랑스 콩) 이력서에서 AWF 추출을위한 최적의 진공 침투 및 원심 분리 방법을 설명합니다. Tendergreen 잎. 이 방법과 다른 식물 종에 대한 프로토콜의 최적화의 한계가 논의된다. AWF 하류 experimen의 넓은 범위에서 사용할 수있는 회수 된apoplast의 조성물의 특성을 추구하고 식물 종 및 유전형, 식물의 개발과 환경 조건에 따라 어떻게 변화하는지, 또는 미생물 apoplast 유체 성장 방법을 결정하고, 그 구성의 변화에 대응하는 TS.
Introduction
식물 apoplast은 식물 세포를 둘러싸고있는 세포 간 공간입니다. 이것은 많은 대사 및 전송 과정이 수행되는 동적 환경이다. apoplast의 주요 구성 요소는 조립 apoplast 위치한 효소 및 구조 단백질 대사에 의해 수정된다 셀벽이다. 건강한 식물 세포에서 apoplast은 일반적으로 아미노산, 당 및 기타 영양소 symport H + (1)에 의해 세포질 apoplast에서 가져올 수 있도록 산성 상태로 유지된다. 자당 교통, apoplast을 통해와 체관부 혈관에 광합성 소스에서 자당 이동하는 동안; 자당은 다음 싱크 기관 2에서 크로스를 절단 apoplastic invertases에 의해 유지 삼투압 전위에 의해 운반된다. 설탕과 다른 영양소도 위쪽으로 운반 및 증산 스트림 (3)을 통해 기공 충치에 축적 될 수있다.
"> apoplast이 많은 병원체가 기생 생활 양식을 확립 환경 틈새 시장을 나타냅니다. 세균 식물 병원균이 될 수 있도록 기공이나 상처 넷을 통해 자연 개구부를 통해 액세스 apoplast에서 높은 밀도로 번식 할 수있는 능력을 가지고있다. 아미노산의 농도를 산 및 세균성 병원균 5,6의 영양 요구 사항을 지원하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 apoplast 토마토 다른 질소 화합물. 병원성 미생물 향해 차 방어 반응은 또한 apoplast에서 세포 외 퍼 옥시다아제에 의한 활성 산소 종의 즉 생산을 발생할 .과 산화 효소 및 가교 및 callose 증착 (7)을 통해 세포벽의 강화 식물 세포 벽 항균 활동 이차 대사 산물이 풍부하다, 이러한 이차 대사 산물의 생화학 적 특성은 종 8 사이에 다릅니다.상기 언급 한 결과ED 및 다른 프로세스는, 리프 apoplastic 유체는 단백질, 당, 유기산, 아미노산, 이차 대사 산물, 및 다른 금속 양이온 (예를 들면, Mg를 2 +, K +, + 나트륨, 칼슘, 철의 2/3 다양한 포함 +). 촬영의 apoplast에서 용질 농도는 apoplast와 목부, 체관과 세포질 (9) 사이에서 발생하는 전송 프로세스의 균형에 의해 주로 제어된다. 그러나, 대사 반응과 미생물 성장은 소비 또는 apoplastic 용질을 생산하고 있습니다. apoplast의 조성물은 식물 종 및 유전형과 빛 사이, 영양 생물 및 비 생물 적 스트레스를 포함하여 9 환경 조건의 변화에 따라 다를 것으로 알려져있다. apoplast의 구성을 공부하고 같은 산화 환원과 삼투 가능성, 산도, 영양 / 대사 가용성 및 효소 활동과 같은 속성을 포함하여, 변경 방법, 하나는 식물이 다시 방법에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다자신의 환경에 좋은지. 이 대사 산물 및 / 또는 이온이, 휘발성 과도하거나 세포벽과 세포막과 연관 될 수있는 공간적으로 체계화되고 동적 구획이므로 이해 또는 apoplast 용액에서 발생하는 분자의 변화를 특징은 복잡하다. 또한, 상이한 분석 기술은 상이한 유형의 화학의 범위를 커버해야한다.
수용성 apoplast의 조성물을 연구, 유체는 일반적으로 조직으로부터 추출 될 필요가있다. 몇 가지 방법이 새롭게 제안 된 필터 스트립 제 10 포함한 다양한 조직으로부터 유체를 추출하는 apoplast 존재하지만, 잎을위한 가장 확립 추출법 침윤 원심이다. 이 기술은 11 ~ 13 이전에 평가되었으며 Lohaus 등. 2001 14는 방법의 기술적 인 매개 변수의 많은에 대한 철저한 검사를 제공합니다. 이름, 침윤-centrifu 같이 암시gation 기술은 본질적으로 잎의 부드러운 원심 분리에 의해 침윤 / apoplastic 유체 혼합물을 회수 하였다 네이티브 apoplastic 유체와 혼합 수성 침윤 유체와 apoplastic 공기 공간의 교체를 포함하는 2 단계 방법이다. 회수 된 유체 희석 및 apoplast에있는 모든 화합물 (아래 참조)가 포함되어 있지 않기 때문에,이 유체는 일반적 apoplast 세척액 (AWF), 또는 때때로 간 세척액보다는 apoplastic 유체로서 알려져있다. 침투 원심 분리 기술은 충분한 양의 단일 또는 풀링 AWF 샘플 생성 하류 생화학 분석 기술 (폭넓게 실시 할 수 있도록 쉽게 확장이다 예 단백질 전기 영동, 효소 활성의 측정, NMR, 크로마토 그래피 및 질량의 많은 유형 분석). 잎 AWF는 공장 식민지 미생물 위트의 상호 작용 연구를위한 성장 매체를 흉내 낸 apoplast로서 유용하다시간 자신의 환경 오.
다음 프로토콜에서 우리는 위 Phaseolus는 이력서 vulgaris의 사용 침투 원심 분리 기술을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. Tendergreen 잎, 및 대사 체학에 초점을 다운 스트림 분석의 몇 가지 예를 제공합니다. 중요한 방법 AWF의 품질이 상이한 리프 타입 절차를 최적화하도록 어드바이스와 함께 부여되는 평가한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물 조직 소스를 최적화
apoplast 추출을 수행 할 때 생물 및 기술 변화가 클 수있다, 따라서 매우 표준화 된 워크 플로우 (그림 1) 실험에서 연속성을 증가하는 것이 도움이된다. 중요하게는, 식물 조직의 소스는 리프 타입, 리프 연령, 성장 / 일의 환경 조건으로 (표 1)의 시간을 포함하여, 표준화되어야한다. 큰 차이는 다른 나뭇잎이 침투되고 AWF 이후 원심 분리에 의해 회수되는 용이성 존재; 이러한 차이는 기공 번호, 조리개의 크기와 엽육 저항 (12, 14)과 관련된다. P. 심지어 다른 품종 중에서도 쉽고 AWF 추출 절차의 수율로 큰 차이가 vulgaris의; 여기에 사용되는 Tendergreen의 다양한 예를 잎에 대한 캐나다 원더 품종보다이 방법을 사용하여 AWF 추출에 더 많은 의무가 있습니다. 이내P.는 apoplastic 추출을 위해 그들에게 분명한 선택을하고, 최초의 진정한 잎에 침투하는 가장 큰 및 가장 쉬운 vulgaris의. apoplastic 공기와 물 볼륨이 AWF의 추출 성 (12, 14)의 차이에 이르는 여러 종의 잎 시대에 따라 변화하는 것으로 나타났다. P.에서 심상, 오래된 잎은 실질적으로 더 어려운 침투 해 원심 분리에 따라 적은 AWF을 얻었다 될; 그들이 전체 확장에 도달 한 시점 따라서 잎 수거 하였다.이어서 침투 AWF를 복구 원심 높은 속도를 필요로하기 어려운 떠난다. 하나는 따라서 신중하게 대규모 AWF의 추출을위한 조직 소스에 따라 결정하기 전에 여러 가지 잎의 종류와 품종을 선별해야한다.
식물 성장 조건은 실험의 컨텍스트 내에서 최대한 표준화되어야한다. 이들이 허용하는 성장 캐비닛의 사용이 바람직하다 일관된 습도, 온도 및 LIGHt 강도 연대는 유지되어야합니다. 등 대사 효소의 농도가 낮의주기 (14)에 걸쳐 다양하기 때문에 잎의 수확은 항상 날의 동일한 시간에 발생한다. 마지막으로, 공장이 모두 비슷한 팽압이 잎 수 있도록, 식물 (~ 1 시간) 수확하기 전에 빨리 물을해야합니다.
잎 침투와 원심 분리의 최적화
세포에 의해 발생하는 기계적 응력이 침투 또는 원심 분리 단계 동안 너무 높으면 인해 부분적인 세포 용해에 AWF의 바람직하지 않은 세포질 오염이 발생합니다. 따라서, 소정의 리프 형 절차는 수율을 최대화하고 AWF 세포질의 오염을 최소화 간의 최적 트레이드 오프해야한다. 모든 경우에, 하나는 AWF 잎 세포의 기계적인 혼란을 피하기 위해 회수 될 수있는 최저 속도로 원심 분리를 사용한다. centrifu의 최적화gation 원심 분리 속도는 속도 범위에 걸쳐 회수 양과 apoplast 오염을 모니터링하여 각 리프 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 그것은 같은 MDH, G6PDH 포도당 인산 이성화 효소로 그 마커 효소의 활동을 관찰되었다, 이러한 활동은 아마도 때문에 세포질 누출 9,12,14에, 빠르게 증가하는 이상 초과하는 임계 원심력 때까지 낮게 유지. 베이커 등. 2012 (11)에 의해 언급 된 바와 같이 원심 분리 단계 동안 지원 파라 필름의 사용은, AWF 추출 효율을 향상시킬 수 있고, 과도한 폴딩 및 압축에 의해 야기 엽신 기계적으로 손상을 최소화 할 수있다. 하나는 AWF 추출의 손상과 완전성의 잎을 조사해야 할 때 또한, 파라 필름의 사용은 원심 분리 후 잎의 시각화를 향상시킵니다.
한정한다 (12)는 D 아르 컷 쌀 잎 섹션에서 AWF 복구의 최적화를 설명ifficult는 침투 때문에 작은 기공 개구의 AWF를 수집하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 필요로합니다. 벼 잎 표면의 젖음성, 어느 증류수 잎 또는 침윤 유체에 계면 활성제를 첨가함으로써 향상 침지 처리, 침투 과정을 용이. 오염 apoplastic 12 모니터링하면서 더 높은 속도를 원심 분리 (6,000 XG)도 사용되었다. 잘라 리프 섹션을 사용하는 경우 세포질 오염조차 상처 부위를 광범위하게 세정하고 더 확산 될 것이라는 위험이 항상있다; 절단 잎 따라서 필요한 경우에만 사용해야합니다.
많은 연구 증류수 침투 유체 (11)로서 사용된다. 그러나, 화합물은 특정 apoplastic 화합물, 특히 13 단백질의 추출을 향상시키기 위해, 예컨대 염 또는 완충제, 침윤 유체에 첨가 될 수있다. Lohaus 14 O를 이온 삼투압 강도의 효과를 평가n은 복구 된 AWF의 구성과는 무시할 수를 발견했다. 침투 배지의 pH의 변화는, 그러나, AWF 조성물 (14)에 영향을 미칠 수있다.
추출 된 apoplastic 유체의 적절한 취급 및 보관이 중요합니다. AWF는 프로테아제 및 다른 효소의 풍부한 13, 20,뿐만 아니라 휘발성 유기 화합물을 함유하는 것으로 나타났다. 따라서,이 얼음하거나 -80 ° C에서 보관 샘플을 유지하는 것이 좋습니다 복구 후 AWF의 구성에 대한 변경 사항을 줄일 수 있습니다. 추출에 의한 단백질 분해, 장기 희석 효소의 불 활성화를 제한하거나 동결 해동을하는 후 또한, AWF의 효소 분석은 가능한 한 빨리 수행되어야한다.
침투 과정 apoplastic 유체 희석하고이 희석 범위를 결정하는 것이 필요하다. 원심 분리 공정은 또한 세포 내 구획에서 물로 희석 AWF있다. 희석 인자는해야한다측정 AWF에 만들어진 에드는 생체 apoplast 화학 물질 농도를 추정하기. 따라서 가능한 한 정확하게 생체 내 대사 물질의 농도에 일치 – 희석 인자는 또한 미생물이 성장 배지를 흉내 apoplast으로서 사용될 때 완전한 힘 AWF 다시 농축하는데 필요하다. 수 가지 변형 침투 유체에 추가 마커 화합물의 희석을 측정함으로써 AWF 희석 인자를 결정하기위한 단계 4에 기재된 방법에 존재한다. 모든 메소드에 대해 AWF 희석 계산 침윤 유체가 상당히 흡수되거나 AWF 복구 프로세스 동안 잎 세포에 의해 희석되지 않은 것으로 가정한다. 이 가정은 이전 침투 단계 (14)가 확인 되었으나 원심 분리 단계에서 확인되지된다. 마커 화합물은 또한, 흡수 운반 또는 apoplast에 동안을 수정해서는 안됩니다. 인디고 카민은 가장 널리 사용하고 철저하게 사용될 염료 시험AWF 희석 계산. 인디고 카민은 양이온 교환 수지와 격리 된 세포벽에 낮은 흡광도를 표시하고 브라 시카 napus에서 AWF 계산, Pisum의 sativum, 까 lycopersicum과 글리신 최대 11,21,22에 적합한 것으로 나타났다. 그러나 일부 잎 유형, 예를 들어, 쌀과 오이에, 인디고 카민 완전히 AWF 희석 요인 12,21의 과소 평가로 이어질 것이다 침투 후 복구 할 수 없습니다 등장. 그 감수성이 특히 스트레스 (24)에서, apoplast에서 생산되는 것으로 알려져있다 슈퍼 옥사이드 (23)에 의해 이사 틴 설포 네이트로 절단 할에 인디고 카민의 회복의 부족 때문일 수 있습니다. 이사 틴 네이트로 인디고 카민 개열은 610 nm에서 흡광도의 손실 및 245 nm에서의 증가를 초래한다. 이 반응은 apoplast에 상당한 정도로 수행 할 것인지, 또는 상기 반응은 infiltrat 슈퍼 옥사이드 제거제의 첨가에 의해 억제 될 수 있는지이온 액은 현재까지 조사되지 않았다. AWF의 안정성 및 복구가보고되지 않은 있지만 블루 덱스 트란이 쌀 AWF 희석 요인의 정량화 대신 인디고 카민의 사용 된 12 잎. 대안 적으로, [14 C] 소르비톨 또는 다른 정량 가능한 내부 표준 물질로서 방사성 표지 화합물 대신 염료 또는 방사능 농도 측정과 유사한 방법으로 11,14,25 희석 계수를 계산하는 데에 감소 사용될 수있다.
기술의 한계
몇 가지주의 사항이 침투 원심 AWF 분리 방법 존재합니다. 먼저, 침윤 동안 apoplast의 희석 공장에서 반응을 유도 할 수있다. 주변 셀 리프 apoplastic 유체의 특정 구성 요소에 대해 감소 된 농도를 검출하는 경우, 그들은 대사 산물 농도의 해석을 왜곡, 상기 대사 배설함으로써 응답 할 수있다. 에이 문제의 평가가 침윤하고 원심 분리 나 액의 침투에 적당한 이온 강도 사이의 시간 차이가 모두 추출 AWF 14, 22의 조성물에 영향을 관찰 하였다. 따라서, 희석 생각된다 apoplast에서 발생하는 모든 인공물이 최소화합니다.
두 번째 잠재적 인 단점은 원심 분리 AWF의 용출이 여러 가지 이유로 apoplast에 존재하는 모든 분자를 포착하지 않습니다. 특히 양이온과 단백질의 일부 화합물은 단단히 음전하 세포벽과 연관되고 13 AWF 용출 될 수있다. 단백질과 같은 다른 분자 (14)를 사용하는 원심 분리 속도로 apoplast에서 효율적으로 용출 너무 클 수 있습니다. 반응성 산소 종은 중요 apoplast 제조 화합물의 클래스 있지만 때문에 이들 화합물의 단기 자연, 그리고 이들의 제조에 대한 요구 불특정 그들의 PR 아르esence 잘 AWF 추출에 의해 캡처되지 않습니다. 그것은 AWF는 apoplast 유체의 생체 구성을 나타내며,이 종에 따라 다를 수 있습니다 얼마나 정확하게 알려져 있지 않다.
여러 분석은 어느 것도 보편적으로 인정되지 않지만, 세포질 오염을 결정하기 위해 존재한다. 주로 세포질 효소 분석 실험 (예를 들어, G6PDH, 탄당 인산 이성화, MDH)를 수행하기 쉬운있는 장점을 가지고 있지만 세포질 누설 (14, 18)과 상관 관계가되지 않을 수 있습니다. 세포질 대사 산물 (예를 들어, 육탄 당 인산염, 엽록소)의 평가는 아마도 더 나타내는하지만 덜 (11)이 설정됩니다. 그럼에도 불구하고, 분석 유형 중 하나는 샘플 사이 apoplastic 오염의 상대 정량 유용 할 수 있습니다. 이상적으로, 여러 개의 독립적 인 측정은 AWF 샘플의 무결성을 확인하는 데 사용되어야한다.
한계가 인정되지만, 침윤-centrifugati여기에 설명 된 기술에 apoplastic 단백질, 일차 및 이차 대사 산물 및 무기 이온의 연구에서 간단하고 강력한 기술 남아있다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
Referenzen
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
