植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用<em>インゲンマメ</em>例として

注：これらの要因が大幅に品質変動とAWF（ 図1）の収率に影響を与えることができるように、植物の成長条件の葉の出発物質の選択および標準化が重要である。考慮すべきパラメータは、表1に示され、議論でより詳細に説明する。 パラメーター例標準化 インゲンマメ トマト シロイヌナズナ 葉の種類最初の真の葉、完全に拡張され、健全な下から2 番目と3 番目の葉、アポプラスト抽出に使用されていない頂端リーフレットを取っ4最大のリーフレット完全に展開ロゼット葉植物の齢 21日 7から9​​週間</tD> 7週間時刻光時代中期（12:00） 光時代中期（12:00） 光時代中期（12:00） 水和すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜きすべての植物はよく1時間収穫前を骨抜きすべての植物はよく1時間収穫前を骨抜きライト 16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1 16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1 週2から10時間の明（短日）、400マイクロモルメートル-2秒-1 湿度 70パーセント 70パーセント 70パーセント温度 22°C光、18℃暗黒 22°C光、18℃暗黒 21°C 標準化されたparameの表1例AWF抽出に使用される葉のためにTERS。 1.生成アポプラスト洗浄液注：このプロトコル中に感染した葉から微生物の病原体をinculding危険なmaterilaは、ドレインを下に洗浄すべきではありません。むしろ適切な廃棄手順を使用する必要があります。 葉の大きさに基づいて装置を選択する。 無針注射器を使用してより小さな葉（ 例えば、シロイヌナズナ、豆）を潜入。注射器に収まらないほど大きい葉を浸透させるために真空フラスコを使用してください。同時に複数の葉に潜入するために真空フラスコメソッドを使用します。 カミソリの刃を使用して、小さなセクションに利用可能な浸潤法には大きすぎる葉を分割します。徹底的に損傷を受けた細胞から滲出する細胞質の汚染物質を除去するために浸透の前に蒸留水で葉の切片をカットすすぐ。 の60mLシリンジを用いて、葉の浸潤。 から葉を切り離しカミソリの刃を使用して、葉柄で植物。例えばトマトなどの化合物の葉の場合は、petioluleでリーフレットを切り離す。 葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収性の組織または紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。 浸透する前に葉の重さを測定します。 （他の浸透液を使用することができる、議論を参照）を注意深くロールおよび/または60 mlシリンジ中に葉を折るし、蒸留水で注射器を満たす。約40ミリリットルマークにプランジャーを下げながら、シリンジ内の空気を取り出します。 手袋をはめた指またはパラフィルムの一部のいずれかと注射器先端をカバーし、その後60ミリリットルマークに外側にプランジャーを引いて、注射器内の負圧を作成します。ゆっくりプランジャーを解放します。 注：細胞溶解および細胞質の汚染を生じ得る圧力を解放すばやく。 シリンジ先端のプラグを抜き、すべての空気を排出し、先端を押して取り外し再接続正圧のささやかな量を作成するためのプランジャーにさらに下方。 浸透した領域の暗く色によって見られるように葉が完全に、浸透されるまで1.2.6 -を繰り返して、1.2.5を繰り返します 。 シリンジから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。 浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。 真空フラスコによる葉の浸潤： カミソリの刃を使用して、葉柄に植物から葉を切り離します。 葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。 浸透する前に葉の重さを測定します。 250ミリリットル以上のサイドアームフラスコの共同で（複数の葉に浸潤している場合、または葉）の葉を置き（他の浸透液を使用することができる、 説明を参照）を蒸 ​​留水をntaining。完全液体と葉をカバーしています。 フラスコに真空を適用します。穏やかに葉から気泡を放出するために攪拌する。慎重にゆっくりと真空をリリース。 注：すぐに真空を解放すると、細胞溶解および細胞質汚染の原因となります。 浸透した領域の暗く色によって見られるように、葉になるまで繰り返しステップ1.3.5は 、完全に浸透させる。 フラスコから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。 浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。 遠心分離によるAWFの回収： 4インチ（10cm）に幅のパラフィルムの一部に葉を置きます。を5mlピペットチップ（または同様のサイズのオブジェクト）を使用して、パラフィルム内の葉をロールアップ。 20ミリリットル注射器にピペットチップでロールアップの葉を挿入します。上向きにすべてのカットの葉のエッジを配置します。きれいな50ミリリットルポリエチレン又はポリカーボネートチューブに注射器を挿入します。 遠心分離し、4℃でスイングバケットローター1,000×gで10分間、管内の注射器。 注：遠心分離の後、葉の視覚的検査は、浸透液の大部分が排出されたことが示される。濃い緑色のパッチは、追加の遠心分離時間が必要であることを示している。 新しい1.5 mlチューブに回収AWFをピペット。 注：AWFの容積は約その葉のための浸透量を一致させる必要があります。ボリュームは、遠心分離時間または遠心分離速度の追加、その後も小さい場合に必要です。 遠心分離する任意の細胞または粒子状物質を除去するために5分間、15000×gでAWFサンプル。また、REMOする0.22μmのフィルターを介してAWFを渡す細胞および粒子状物質VEの。 新しいチューブに上清をピペットで。ストレージまで氷上にサンプルを保管してください。 -80℃でAWFのサンプルを保管してください。 細胞質汚染2.アッセイ酵素反応（ 例えば、タンパク質分解）を最小化し、遠心分離工程が完了した直後にアッセイを実行するために氷上でAWFのサンプルを保管してください。 NOTE：代謝産物アッセイのために、試料は直ちに抽出後に凍結されてもよいし、使用するまで-80℃で保存した。 標準のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）アッセイプロトコルの場合は15を参照してください。それ以外の場合は、市販のMDHアッセイキットを使用しています。 標準グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）アッセイプロトコル16を参照のこと;それ以外の場合は、市販のG6PDHアッセイキットを使用しています。 例えば、グルコース-6-リン酸（G-6-P）のような細胞代謝産物の定量化のためのステップ5に記載したようにGC-MSを使用して</stro> NG。そうでない場合は、G-6-Pを直接アッセイ用の市販のキットを使用。 アポプラスト希釈ファクター3.計算 ステップ1.2.4または1.3.4（例えば、蒸留水）に上記で使用浸潤液の2つのボリュームが準備します。 50μMの最終濃度を1液に、インジゴカルミン粉末を追加し、他には何も追加しません。 プレートリーダーを用いてインジゴカルミン浸潤溶液200μlの610 nmの（OD 610）での吸光度を測定します。インジゴカルミンなしでODを浸透液の610 200μlのを減算することにより、この値を修正してください。下記の式にOD 610infiltrateとしてこの補正された値を代入します。 （インジゴカルミンとない）の両方浸潤ソリューションと（ ステップ1.2または1.3）上記のように、少なくとも3回の反復の葉の浸潤を実行します。 浸透後、R蒸留水で葉で、InSe外表面に残っているインジゴカルミン存在を削除します。 （ ステップ1.4）上記のように遠心分離を進めます。 インジゴカルミンAWF抽出200μlの平均OD 610を決定します。インジゴカルミン無料AWF200μlの平均OD 610値を減算して、この値を修正してください。下記の式にOD 610AWFとしてこの補正された値を代入します。 ように補正吸光度値から（ すなわち、倍希釈）、希釈係数を計算する。 アポプラスト希釈係数= ODの610infiltrate /（OD 610infiltrate – OD 610AWF） プランタアポプラスト液中の濃度/作用を推定する希釈倍率によってAWFから乗算濃度または活性値。 凍結乾燥により完全な強さにAWFの4濃度凍結乾燥機とAの電源を入れます作業温度及び圧力で安定させるためにLLOW。 新鮮なまたは保存されAWFサンプルの所望の量をプール。 2ミリリットル遠心管に均等にサンプルを配布します。 再構成ボリュームを決定します。 凍結乾燥/アポプラスト希釈係数の前に再構成ボリューム=ボリューム蓋を閉じた状態で、液体窒素中でチューブを凍結する。 一つ以上のチルド凍結乾燥容器に凍結されたチューブを転送します。チューブを転送する一方で、ガス交換を可能にするために鋭利なもので刺してきたものにふたを交換してください。 凍結乾燥機に血管を取り付け、完全にサンプルを凍結乾燥。 マシンからサンプルを取り出し、蒸留水を算出した額を加算してAWFを再構成する。 unpierced蓋を交換し、-80℃でサンプルを記憶。 ガスクロマトグラフィー質量分析法17 5.代謝物の分析 <OL> 1.5ミリリットルチューブにピペットAWF200μlの内部標準として10μg/ mlのリビトールを含むメタノール700μlのを追加します。 10分間70℃で加熱する。 11000×gで10分間遠心。 新しい1.5 mlチューブに上清700μlのを転送します。 10秒間の冷クロロホルムと渦の375を添加する。 10秒間のdH 2 Oと渦の500を添加する。 2200×gで15分間遠心。 その後、熱することなく、完全に真空濃縮器でサンプルを乾燥、新しい1.5ミリリットルチューブに上層の水層を150μlのを転送します。 20 mg / mlのメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン30μlのサンプルを溶解する。 2時間激しく振とうしながら70℃でインキュベートする。 MSTFA50μlの（N-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）を加える。 30分間振盪しながら37℃でインキュベートする。 GC-MSコンプへの転送サンプルatibleガラスバイアル。 サンプルのGC-MS分析を実行します。 Lisec らを参照してください。2009年17、GC-MS機器のセットアップとパフォーマンスの詳細については。