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Biologie

La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l'estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo<em> Phaseolus vulgaris</em> Come un esempio

Published: December 19, 2014
doi:
10.3791/52113
, , , ,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford, 2School of Education of Vitoria-Gasteiz,University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Biosciences,University of Exeter

Summary

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Abstract

Il apoplast è un compartimento extracellulare distinta in tessuti vegetali che si trova all'esterno della membrana plasmatica e comprende la parete cellulare. Il compartimento apoplastico di foglie delle piante è il sito di alcuni importanti processi biologici, tra cui la formazione della parete cellulare, nutrienti cellulari e l'assorbimento di acqua e di esportazione, le interazioni pianta-endophyte e le risposte di difesa a patogeni. Il metodo di infiltrazione-centrifugazione è ben definito come una tecnica robusta per l'analisi della composizione apoplast solubile di diverse specie vegetali. Il liquido ottenuto con questo metodo è comunemente noto come apoplast fluido di lavaggio (AWF). Il protocollo che segue descrive un metodo di infiltrazione vuoto e centrifugazione ottimizzato per l'estrazione AWF da Phaseolus vulgaris (fagiolo) cv. Tendergreen foglie. Le limitazioni di questo metodo e l'ottimizzazione del protocollo per altre specie vegetali sono discussi. Recuperato AWF può essere utilizzato in una vasta gamma di speri vallets che cercano di caratterizzare la composizione della apoplast e come varia in risposta alle specie vegetali e il genotipo, lo sviluppo delle piante e delle condizioni ambientali, o per determinare come i microrganismi crescono in nell'apoplasto fluido e rispondere ai cambiamenti nella sua composizione.

Introduction

Il apoplast impianto è lo spazio intercellulare che circonda le cellule delle piante. Questo è un ambiente dinamico in cui molti processi metabolici e dei trasporti si svolgono. Il principale componente strutturale del apoplast è la parete cellulare, che viene assemblata e modificato da enzimi, proteine ​​strutturali e metaboliti situati all'interno nell'apoplasto. In cellule vegetali sani nell'apoplasto generale mantenimento in uno stato acido permettendo aminoacidi, zuccheri e altre sostanze nutritive per essere importati dal apoplast al citoplasma da H + symport 1. Durante il trasporto di saccarosio, si muove saccarosio da fonti fotosintetici attraverso il apoplast e in vascolare floema; saccarosio viene poi trasportato da un potenziale osmotico mantenuto da invertases apoplastico da tagliare saccarosio negli organi lavandino 2. Zuccheri e altre sostanze nutritive possono essere trasportati verso l'alto e si accumulano in cavità stomatici attraverso il flusso di traspirazione 3.

"> Il apoplast rappresenta anche una nicchia ambientale in cui molti agenti patogeni stabilire il loro stile di vita parassitaria. Patogeni batterici hanno la capacità di moltiplicarsi di alta densità nell'apoplasto, che accedono attraverso le aperture naturali come stomi o attraverso ferite 4. La concentrazione di amino acidi e altri composti azotati a pomodoro apoplast hanno dimostrato di essere sufficiente a sostenere il fabbisogno nutritivo di batteri e funghi patogeni 5,6. risposte di difesa primari verso patogeni microbici si verificano anche nell'apoplasto, vale a dire la produzione di specie reattive dell'ossigeno da perossidasi extracellulari . e ossidasi e il rafforzamento della parete cellulare attraverso il cross-linking e callosio deposizione 7 La parete cellulare delle piante è ricco di metaboliti secondari con attività anti-microbiche, la natura biochimica di questi metaboliti secondari varia tra le specie 8.

In conseguenza di quanto sopra-menzioneed e altri processi, fluido foglia apoplastica contiene una varietà di proteine, zuccheri, acidi organici, amminoacidi, metaboliti secondari, metalli e altri cationi (ad esempio, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Concentrazione del soluto nell'apoplasto di germogli sono controllati in gran parte l'equilibrio dei processi di trasporto che si verificano tra la apoplast e lo xilema, floema e il citoplasma 9. Tuttavia, le reazioni metaboliche e la crescita microbica consumano o producono soluti apoplastico. La composizione del apoplast è noto a differenziarsi tra specie vegetali e genotipi e in risposta ai cambiamenti delle condizioni ambientali, tra cui la luce, la nutrizione e stress biotici e abiotici 9. Studiando la composizione del apoplast e come cambia, incluse le proprietà quali redox e potenziale osmotico, pH, nutrienti / disponibilità metabolita e attività enzimatiche, si può acquisire nuove intuizioni su come le piante rispondere al loro ambiente. Intesa o caratterizzare i cambiamenti molecolari che si verificano nella soluzione nell'apoplasto è complicata perché è un vano spazialmente strutturato e dinamico in cui metaboliti e / o ioni possono essere volatili, transitoria o associati con la parete cellulare e la membrana plasmatica. Inoltre, diverse tecniche analitiche sono tenuti a coprire la gamma di diversi tipi di sostanze chimiche.

Per studiare la composizione del apoplast solubile, fluido di solito deve essere estratta dal tessuto. Esistono diversi metodi per estrarre apoplast fluido da vari tessuti, compreso un nuovo metodo proposto striscia di filtro 10, ma il metodo di estrazione più stabilito per foglie è infiltrazioni-centrifugazione. Questa tecnica è stata valutata in precedenza 11-13 e Lohaus et al. 2001 14 fornire un esame approfondito di molti dei parametri tecnici del metodo. Come suggerisce il nome, l'infiltrazione-centrifugogazione tecnica è un metodo in due fasi che coinvolge essenzialmente la sostituzione della camera d'aria con un fluido apoplastica infiltrazioni acquosa, che si mescola con il fluido apoplastica nativa, seguita dal recupero della miscela fluida infiltrazioni / apoplastica delicatamente centrifugazione delle foglie. Come il fluido recuperato viene diluito e non contiene tutti i composti presenti nell'apoplasto (vedi sotto), questo fluido è comunemente noto come apoplast fluido di lavaggio (AWF), o fluido di lavaggio volte intercellulare, piuttosto che fluido apoplastica. La tecnica di infiltrazione-centrifugazione è facilmente scalabile permettendo campioni singoli o raggruppati AWF di volume adeguato da generare e sottoposti a una vasta gamma di tecniche biochimiche e analisi a valle (ad esempio, elettroforesi proteine, la misurazione dell'attività enzimatica, NMR, molti tipi di cromatografia e messa spettrometria). Leaf AWF è anche utile come apoplast imitando terreno di coltura per studiare l'interazione tra pianta colonizzatrice microbi with loro ambiente 5.

Nei seguenti protocolli descriviamo come eseguire la tecnica di infiltrazione-centrifugazione utilizzando Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen foglie, e fornire alcuni esempi di analisi a valle con un focus sulla metabolomica. È importante sottolineare che, i metodi per valutare la qualità di AWF sono forniti insieme a consigli per ottimizzare la procedura per i diversi tipi di foglia.

Protocol

NOTA: La scelta del materiale di partenza foglie e standardizzazione delle condizioni di crescita delle piante è fondamentale in quanto questi fattori possono influenzare notevolmente la qualità, la variabilità e la resa di AWF (Figura 1). I parametri da considerare sono riportati nella tabella 1 e sono discussi più dettagliatamente nella discussione. Parametro Standardizzazioni Esempio Phaseolus vulgaris Solanum lycopersicum Arabidopsis thaliana Tipo Leaf Prime foglie vere, completamente ampliata, sano 2 ° e 3 ° foglie a partire dal basso, 4 grandi volantini presi opuscolo apicale non utilizzati per l'estrazione apoplasto Foglie rosetta completamente espanse L'età delle piante 21 giorni 7 – 9 weeks </td> 7 settimane Ora del giorno Medio periodo luce (00:00) Medio periodo luce (00:00) Medio periodo luce (00:00) Idratazione Tutte le piante ben irrigate 1 ora pre-raccolta Tutte le piante ben irrigate 1 ora pre-raccolta Tutte le piante ben irrigate 1 ora pre-raccolta Luce Luce 16 ore, 400 mmol m -2 sec -1 Luce 16 ore, 400 mmol m -2 sec -1 10 ore di luce (giorno corto) di settimana 2, 400 mmol m -2 sec -1 Umidità 70% 70% 70% Temperatura 22 ° C la luce, 18 ° C scuro 22 ° C la luce, 18 ° C scuro 21 ° C Tabella 1. Esempi di para standardizzataTERS di foglie utilizzate in estrazioni AWF. 1. Generazione apoplasto Washing Fluid NOTA: Durante questo protocollo materila pericolosi inculding patogeni microbici da foglie infette non dovrebbe essere lavato in malora; dovrebbero essere utilizzate procedure di smaltimento piuttosto corrette. Scegli apparecchi in base alle dimensioni del foglio: Infiltrati foglie più piccole (ad esempio, Arabidopsis, fagioli) con una siringa senza ago. Utilizzare una boccetta di vuoto di infiltrarsi foglie che sono troppo grandi per entrare in una siringa. Utilizzare il metodo thermos di infiltrarsi foglie più contemporaneamente. Dividere le foglie che sono troppo grandi per il metodo di infiltrazione disponibile in sezioni più piccole con una lama di rasoio. Sezioni foglia sciacquare tagliate in acqua distillata prima di infiltrazione per rimuovere i contaminanti citoplasmatici che trasudano dalle cellule danneggiate. Foglia infiltrazione utilizzando una siringa da 60 ml: Staccare la foglia dalimpianto al picciolo utilizzando una lama di rasoio. Per foglie composte, come il pomodoro, staccare volantini al petiolule. Sciacquare la foglia appena asportato mediante immersione in acqua distillata per rimuovere i contaminanti di superficie delle foglie. Asciugare la foglia tamponando delicatamente con carta assorbente o carta. Misurare il peso anta prima infiltrazione. Rotolare delicatamente e / o piegare la foglia in una siringa da 60 ml e riempire la siringa con acqua distillata (altri fluidi infiltrazione possono essere utilizzati, vedi la discussione). Espellere l'aria all'interno della siringa, riducendo al contempo il pistone a circa i 40 ml. Coprire la punta della siringa sia con un dito guanto o un pezzo di Parafilm, quindi creare pressione negativa all'interno della siringa tirando lo stantuffo verso l'esterno fino alla tacca 60 ml. Lentamente rilasciare lo stantuffo. NOTA: rilasciando velocemente la pressione può provocare la lisi cellulare e la contaminazione citoplasmatica. Scollegare la punta della siringa ed espellere l'aria, quindi ricollegare la punta e stampaulteriori verso il basso lo stantuffo per creare una modesta quantità di pressione positiva. Ripetere i punti 1.2.5 – 1.2.6 fino a quando la foglia è completamente infiltrato, come si vede dal colore buia delle zone infiltrate. Togliere la foglia dalla siringa. Delicatamente ma accuratamente asciugare la foglia con carta assorbente per rimuovere il liquido in superficie. Misurare il peso dell'anta infiltrato. Calcolare la differenza di peso prima e dopo l'infiltrazione che si avvicini molto il volume infiltrazioni. Leaf infiltrazione di boccetta di vuoto: Staccare la foglia dalla pianta al picciolo utilizzando una lama di rasoio. Sciacquare la foglia appena asportato mediante immersione in acqua distillata per rimuovere i contaminanti di superficie delle foglie. Asciugare la foglia tamponando delicatamente con carta assorbente. Misurare il peso anta prima infiltrazione. Posizionare la foglia (o foglie se infiltrazione foglie più) in 250 ml o più grande lato pallone braccio containing acqua distillata (altri fluidi infiltrazione possono essere utilizzati, vedi la discussione). Coprire completamente le foglie con il liquido. Applicare un vuoto al pallone. Agitare delicatamente per liberare le bolle d'aria dalle foglie. Cura e rilasciare lentamente il vuoto. NOTA: rilasciando rapidamente il vuoto può causare la lisi cellulare e la contaminazione citoplasmatica. Ripetere il punto 1.3.5 fino a quando la foglia è completamente infiltrato, come si vede dal colore buia delle zone infiltrate. Togliere la foglia dal pallone. Delicatamente ma accuratamente asciugare la foglia con carta assorbente per rimuovere il liquido in superficie. Misurare il peso dell'anta infiltrato. Calcolare la differenza di peso prima e dopo l'infiltrazione che si avvicini molto il volume infiltrazioni. Recupero di AWF per centrifugazione: Posizionare la foglia su un pezzo di 4 pollici (10 cm) di larghezza Parafilm. Con una pipetta punta 5 ml (o un oggetto simile di dimensioni),arrotolare la foglia all'interno del Parafilm. Inserire la foglia arrotolata con puntale in una siringa da 20 ml. Posizionare eventuali bordi del foglio taglio rivolti verso l'alto. Inserire la siringa in un 50 ml di polietilene o policarbonato provetta pulita. Centrifugare la siringa nel tubo per 10 minuti a 1000 xg in un rotore secchio oscillante a 4 ° C. NOTA: esame visivo delle foglie seguenti centrifugazione dovrebbe rivelare che la maggior parte del fluido di infiltrazione è stato espulso. Macchie verdi più scuri indicano che è necessario tempo di centrifugazione supplementare. Pipettare il AWF recuperato in freschi provette da 1,5 ml. NOTA: Il volume di AWF dovrebbe corrispondere a circa il volume di infiltrazione per quella foglia; se il volume è meno tempo di centrifugazione supplementare o è necessaria velocità di centrifugazione. Centrifugare i campioni AWF a 15.000 xg per 5 minuti per rimuovere eventuali cellule o particolato. In alternativa, passare il AWF attraverso un filtro da 0,22 micron a remove cellule e particolato. Pipettare il surnatante in una nuova provetta. I campioni in ghiaccio fino archiviazione. Conservare i campioni AWF a -80 ° C. 2. Test per citoplasmatica contaminazione Mantenere i campioni AWF sul ghiaccio per ridurre al minimo le reazioni enzimatiche (ad esempio, proteolisi) ed eseguire i test subito dopo le fasi di centrifugazione sono completi. NOTA: Per i saggi di metaboliti, i campioni possono essere immediatamente congelati dopo l'estrazione e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso. Per un malato deidrogenasi standard (MDH) protocollo di dosaggio vedere 15; altrimenti utilizzare un kit di dosaggio MDH disponibile in commercio. Per un deidrogenasi di glucosio-6-fosfato standard (G6PDH) protocollo di dosaggio vedere 16; altrimenti utilizzare un kit di dosaggio G6PDH disponibile in commercio. Per la quantificazione di metaboliti citoplasmatici quali glucosio-6-fosfato (G-6-P) utilizzare GC-MS come descritto al punto 5 </strong>. Altrimenti, utilizzare un kit disponibile in commercio per il dosaggio diretto di G-6-P. 3. Calcolo del apoplasto Fattore di diluizione Preparare due volumi del fluido infiltrazione utilizzato soprattutto nella fase 1.2.4 o 1.3.4 (ad esempio, acqua distillata). Aggiungere la polvere carminio indaco con una soluzione ad una concentrazione finale di 50 pM, aggiungere nulla all'altro. Misurare l'assorbanza a 610 nm (OD 610) di 200 ml di soluzione di infiltrazione indigotina con un lettore di piastre. Correggere questo valore sottraendo l'OD 610 di 200 ml di soluzione di infiltrazione senza indigo carmine. Sostituire il valore corretto come OD 610infiltrate nell'equazione sotto. Effettuare almeno tre infiltrazioni foglia replica come sopra (punto 1.2 o 1.3) con entrambe le soluzioni di infiltrazione (con e senza indigo carmine). Dopo infiltrazione, rInse le foglie in acqua distillata per rimuovere ogni residuo indigotina presenti sulle superfici esterne. Procedere con centrifugazione come sopra (punto 1.4). Determinare il valore medio di 610 200 l di estrazioni AWF indaco carminio. Correggere questo valore sottraendo il valore medio OD 610 di 200 ml di indigo carmine libera AWF. Sostituire il valore corretto come OD 610AWF nell'equazione sotto. Calcolare il fattore di diluizione (cioè, piegare la diluizione) dai valori di assorbanza corretti come: Apoplast fattore di diluizione = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate – OD 610AWF) I valori di concentrazione o di attività Moltiplicare dal AWF per il fattore di diluizione per stimare la concentrazione / attività nel fluido apoplastico in planta. 4. Concentrazione di AWF a piena forza per Liofilizzazione Accendere il freeze-asciugatrice e unllow a stabilizzarsi alla temperatura e pressione di lavoro. Pool la quantità desiderata di campioni AWF freschi o conservati. Distribuire i campioni in modo uniforme tra 2 tubi ml centrifuga. Determinare il volume di ricostituzione: Ricostituzione volume = volume prima di liofilizzazione / apoplasto fattore di diluizione Con le palpebre chiuse, bloccare i tubi in azoto liquido. Trasferire i tubi congelati per una o più navi di liofilizzazione refrigerati. Durante il trasferimento i tubi, sostituire il coperchio con quello che è stato trafitto con un oggetto appuntito per consentire lo scambio di gas. Fissare le navi verso il congelamento-essiccatoio e liofilizzare completamente i campioni. Rimuovere i campioni dalla macchina e ricostituire il AWF aggiungendo la quantità calcolata di acqua distillata. Sostituire il coperchio forate e conservare i campioni a -80 ° C. 5. Metabolita Analisi per gascromatografia spettrometria di massa 17 <ol> Pipettare 200 ml di AWF in una provetta da 1,5 ml Aggiungere 700 ml di metanolo contenenti 10 ug / ml ribitol come standard interno. Riscaldare a 70 ° C per 10 min. Centrifugare per 10 minuti a 11.000 x g. Trasferire 700 ml di surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Aggiungere 375 ml di cloroformio freddo e vortex per 10 sec. Aggiungere 500 ml di dH 2 O e vortex per 10 sec. Centrifugare per 15 min a 2200 x g. Trasferire 150 microlitri dello strato acquoso superiore in una nuova provetta da 1,5 ml, poi asciugare i campioni completamente in un concentratore a vuoto senza calore. Sciogliere i campioni in 30 ml di piridina contenenti 20 mg / ml cloridrato methoxyamine. Incubare a 70 ° C, mentre agitando vigorosamente per 2 ore. Aggiungere 50 ml di MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetammide). Incubare a 37 ° C sotto agitazione per 30 min. Campioni di trasferimento di GC-MS compfiale di vetro atibile. Eseguire l'analisi GC-MS dei campioni. Fare riferimento a Lisec et al. 2009 17, per i dettagli sulla GC-MS configurazione e le prestazioni delle apparecchiature.

Representative Results

I risultati tipici per estrazioni AWF effettuati su sano tre settimane vecchio P. vulgaris cv. Tendergreen foglie, usando acqua distillata come fluido di infiltrazione sono riportati nella Tabella 2. Giovane P. foglie vulgaris sono suscettibili di infiltrazioni, e alla velocità di centrifugazione qui utilizzato (1,000 xg) la rimozione della maggior parte del liquido infiltrazione di centrifugazione può essere visto direttamente come le foglie ritornano al loro colore verde originale. P. foglia vulgaris peso fresco era in media 1,1 xg prima infiltrazione e ha prodotto 0,5 ml di AWF per grammo di peso fresco. La concentrazione di proteine ​​della AWF è stato determinato in 0,18 ± 0,08 mg / ml con un saggio di proteine ​​Bradford standard. Il fattore di diluizione per queste foglie, calcolato misurando la diluizione indigo carmine, è stato di 2,3 ± 0,3 volte. I valori di cui sopra possono variare notevolmente tra le specie e gli esperimenti pilota sono necessari per determinare la resa di AWF per grammo foglia siamo freschiestra, nonché la concentrazione di proteine ​​AWF e fattore di diluizione che può essere previsto per un determinato tipo di foglia. Danneggiamento l'integrità delle cellule può verificarsi sia durante la fase di infiltrazione, se le variazioni di pressione sono troppo rapida, e durante la fase di centrifugazione se la forza centrifuga è troppo alta. È pertanto necessario saggiare campioni AWF per i marcatori di contaminazione citoplasmatica; idealmente, vengono eseguite diverse analisi indipendenti. Qui, i risultati di tre possibili test sono riportati in Tabella 2. In estrazioni ben condotti di P. vulgaris AWF, G6PDH era inosservabile da un test enzimatico standard. Ciò è coerente con altri rapporti in cui l'attività G6PDH diventa rilevabile solo al di sopra di una soglia forza centrifuga 12. Al contrario, un livello basale di attività malato deidrogenasi (2,5 U / ml) era rilevabile in ciascuno P. campioni vulgaris AWF utilizzando un test metabolico normale. Aumentare la centrifuga perce di sopra di una soglia di 1.000 xg portato ad un'aumentata attività MDH (risultati non mostrati). Come nell'apoplasto da altre specie è nota la presenza di attività MDH endogena 18, la quantità rilevata qui è considerato un'autentica attività apoplastico e significativi aumenti di sopra di questo livello di base sono indicativi di contaminazione. Metaboliti che si pensa siano prevalentemente citoplasmatica, come esosi-6-fosfato, possono anche essere utilizzati per valutare la contaminazione di AWF. Qui, l'analisi GC-MS rilevato zero o tracce livelli di G-6-P in estrazioni AWF. Per contro, in sezioni di radice di mais taglio, G-6-P è stato rilevato dopo estrazione AWF a tutte le velocità di centrifugazione e di aumento della concentrazione a velocità più elevate, indicando contaminazione citoplasmatica 10. Analisi dei metaboliti mediante GC-MS di P. vulgaris foglia AWF produce tipicamente 40-60 metaboliti identificabili e circa lo stesso numero di composti non identificabili (Figura 2). Oacidi nici, zuccheri semplici e aminoacidi rappresentano la maggior parte dei metaboliti identificabili, tuttavia, metaboliti secondari delle piante sono stati anche individuati e quantificati dalla AWF 11. Diversi esempi di questi picchi diverse classi di molecole sono etichettati in Figura 2 sono altre tecniche analitiche valle sono applicabili a questi campioni AWF quantificare varie molecole, per esempio:. ICP-MS, NMR, HPLC, spettroscopia di assorbimento atomico, spettrometria di massa proteica. La componente proteica della apoplast è rappresentata anche nel AWF come mostrato nella Coomassie Brilliant Blue tinto SDS-PAGE gel in figura 3. Tra gli altri ruoli, gli enzimi apoplastica sono responsabili della sintesi della parete cellulare e la creazione di extracellulare reattiva specie di ossigeno. Studi di proteomica di AWF di varie specie hanno individuato decine di singole proteine ​​e dimostrato che la componente proteica del apoplast risponde a Envirolo stress nmental 13,19. Idealmente estratto AWF dovrebbe essere esente da contaminazione da proteine ​​citoplasmatici quali Rubisco; Tuttavia, in pratica è difficile da raggiungere. La presenza di una banda proteica Rubisco a ~ 53 kDa dopo SDS-PAGE fornisce un ulteriore test qualitativo per la integrità dei campioni AWF. Ad esempio, il campione caricato in corsia 2 nella figura 3 contiene una maggiore quantità di contaminazione Rubisco quello di corsia 1. Phaseolus vulgaris AWF Volume di AWF (ml g -1 foglia FW) 0.49 ± 0.09 Protein conc. (Mg ml -1) 0.18 ± 0.08 Fattore di diluizione 2.3 ± 0.3 Attività G6PDH (U ml -1) <td> Nessuno rilevato Glc-6-P (mg ml -1) none rilevato Attività MDH (U ml -1) 2.5 ± 0.9 Tabella 2. I risultati tipici per AWF estrazioni da P. vulgaris cv. Tendergreen foglie. Figura 1. Flusso di lavoro di estrazione apoplast standard. I numeri si riferiscono ai passaggi del protocollo. Figura 2. Un esempio GC-MS Cromatogramma di P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF I picchi esempio metaboliti numerate sono: 1-malonato, 2-fosfato, 3-succinato, 4-sconosciuta, 5-malato, 6-asparagina, 7-ribitol (st internaAndard), 8-citrato, 9-glucosio, 10-inositolo, acido 11-caffeico, 12-saccarosio. Figura 3. Un esempio SDS-PAGE Coomassie macchiato gel di P. Vulgaris estratti di foglie AWF. Questo gel fornisce un confronto tra le componenti proteiche di due estrazioni AWF che differiscono per la quantità di contaminazione citoplasmatica dall'abbondante enzima plastidiale Rubisco. Dopo l'estrazione AWF entrambi i campioni sono stati sottoposti a proteine ​​acetone precipitazione in eccesso di 4 volte (v / v) di acetone freddo e resolubilized in acqua a un decimo del volume originale. Corsie 1 e 2 contengono 40 mg di proteine. La banda corrispondente alla grande catena Rubisco (~ 53 kDa) è indicato da una freccia. M r: proteina marcatori di peso molecolare.

Discussion

Ottimizzare la fonte tessuto vegetale

Variazione biologica e tecnico può essere grande quando si esegue apoplast estrazioni, quindi un flusso di lavoro altamente standardizzata è utile per aumentare la continuità attraverso esperimenti (Figura 1). È importante sottolineare che la fonte di tessuto vegetale deve essere standardizzata, tra cui il tipo foglia, l'età foglia, / le condizioni ambientali di crescita e l'ora del giorno (Tabella 1). Esistono grandi differenze nella facilità con cui foglie diverse sono infiltrati e l'AWF, successivamente recuperate mediante centrifugazione; queste differenze sono correlate con il numero di stomi, l'apertura e la resistenza mesophyll 12,14. Anche tra le diverse cultivar di P. vulgaris ci sono grandi differenze nella facilità e la resa della procedura di estrazione AWF; ad esempio le foglie della varietà Tendergreen usato qui sono più suscettibili di estrazione AWF con questo metodo che il Wonder cultivar canadese. EntroP. vulgaris le prime foglie vere sono il più grande e il più facile da infiltrarsi, che li rende la scelta più ovvia per estrazioni apoplastico. Il volume di aria e acqua apoplastica ha dimostrato di variare con l'età foglia in diverse specie portano a differenze di AWF estraibilità 12,14. In P. vulgaris, foglie più vecchie diventano sostanzialmente più difficile per infiltrarsi e produrre meno AWF su centrifugazione; quindi foglie sono state raccolte quando hanno raggiunto piena espansione. Foglie di difficile infiltrarsi successivamente richiedere velocità di centrifugazione più elevate per recuperare l'AWF. Bisogna dunque schermo con attenzione diversi tipi di foglie e varietà diverse prima di decidere su una fonte di tessuto per le estrazioni AWF larga scala.

Condizioni di crescita delle piante devono essere standardizzati quanto possibile nell'ambito dell'esperimento. L'uso di di coltura è preferibile in quanto permettono di umidità costante, la temperatura e lighreggimenti intensità t da mantenere. La raccolta delle foglie deve sempre avvenire alla stessa ora del giorno perché le concentrazioni di metaboliti, enzimi, ecc variano durante il ciclo diurno 14. Infine, per garantire che l'impianto lascia tutti hanno simili turgore, le piante dovrebbero essere annaffiati poco prima (~ 1 ora) il raccolto.

Ottimizzazione della foglia infiltrazione e centrifugazione

Indesiderato contaminazione citoplasmatica del AWF causa di lisi cellulare parziale risulterà se lo stress meccanico incontrato dalle cellule è troppo alta durante le fasi di infiltrazione o centrifugazione. Pertanto, la procedura per un dato tipo foglio deve essere un compromesso ottimale tra massimizzare il rendimento e minimizzare la contaminazione citoplasmatica del AWF. In tutti i casi, si dovrebbe usare la velocità più bassa centrifugazione a cui AWF può essere recuperato per evitare possibili distruzione meccanica delle celle foglia. Ottimizzazione del centrifugovelocità gazione deve essere determinata empiricamente per ciascun tipo del foglio controllando il volume recuperato e apoplast contaminazione su una gamma di velocità di centrifugazione. È stato osservato che le attività enzimatiche marcatore, come MDH, G6PDH e glucosio-fosfato isomerasi, rimangono bassi fino una soglia forza centrifuga è superato, sopra il quale queste attività aumentano rapidamente, presumibilmente a causa di perdite citoplasmatica 9,12,14. L'uso di Parafilm per supporto durante la fase di centrifugazione, come osservato da Baker et al. 2012 11, può migliorare l'efficacia dell'estrazione AWF e può minimizzare i danni meccanici alla lama foglia causata da eccessiva piegatura e compressione. Inoltre, l'uso di Parafilm migliora la visualizzazione della foglia dopo centrifugazione quando si deve esaminare il foglio per danni e completezza di estrazione AWF.

Nouchi 12 descrivono l'ottimizzazione del recupero AWF dalle sezioni di foglie di riso taglio, che sono difficult per infiltrarsi e richiedono velocità di centrifugazione più elevate per raccogliere AWF a causa delle loro piccole aperture stomatiche. Migliorata bagnabilità della superficie della foglia di riso, sia presoaking le foglie in acqua distillata o l'aggiunta di un tensioattivo al fluido di infiltrazione, facilitato il processo di infiltrazione. Una velocità di centrifugazione più elevata (6.000 xg) è stato utilizzato anche durante il monitoraggio della contaminazione apoplastico 12. Quando si utilizza sezioni foglia taglio c'è sempre il rischio che la contaminazione citoplasmatica sarà più prevalente anche con vasta lavaggio dei siti ferita; foglie tagliate dovrebbero pertanto essere utilizzati quando necessario solo.

Per molti studi acqua distillata è usata come l'infiltrazione del fluido 11. Tuttavia, i composti possono essere aggiunti al fluido di infiltrazione, come ad esempio sali o buffer, per migliorare l'estrazione di alcuni composti apoplastico, in particolare proteine ​​13. Lohaus 14 valutato l'effetto di forza ionica e osmotica on la composizione del AWF recuperato e ritenuto trascurabile. Variazioni pH del mezzo di infiltrazione, tuttavia, possono influenzare la composizione AWF 14.

Corretta gestione e lo stoccaggio del liquido apoplastico estratto è importante. AWF ha dimostrato di contenere una grande varietà di proteasi e altri enzimi 13,20, così come composti organici volatili. Pertanto, per ridurre i cambiamenti nella composizione della AWF dopo il recupero si raccomanda di mantenere i campioni in ghiaccio o altrimenti conservati a -80 ° C. Inoltre, saggi enzimatici di AWF devono essere eseguite non appena possibile dopo l'estrazione di limitare inattivazione enzimatica dovuta alla proteolisi, la diluizione prolungata o congelamento-scongelamento.

Il processo di infiltrazione diluisce fluido apoplastica ed è spesso necessario determinare l'entità di questa diluizione. La fase di centrifugazione può anche diluire l'AWF con acqua da compartimenti intracellulari. Un fattore di diluizione è bisognoed a stimare vivo apoplast concentrazioni chimiche a quando le misurazioni sono effettuate su AWF. È necessario anche un fattore di diluizione di concentrarsi AWF di nuovo al completo quando viene utilizzato come un apoplast imitando terreno di coltura per microbi – corrispondenti quindi a concentrazioni del metabolita vivo il più accuratamente possibile. Esistono diverse varianti del metodo descritto nel passaggio 4 per determinare il fattore di diluizione AWF misurando la diluizione di un composto marcatore aggiunto al fluido di infiltrazione. Per tutti i metodi di calcolo di diluizione AWF presuppone che il fluido infiltrazione non è sensibilmente assorbita o diluito dalle cellule foglia durante il processo di recupero AWF. Questa ipotesi è stata verificata in precedenza per la fase di infiltrazione 14 ma non verificate per la fase di centrifugazione. Il composto marcatore non deve essere assorbita, trasportato o modificato mentre nell'apoplasto. Indigo carmine è il più utilizzato e testato a fondo di coloranti utilizzatiper i calcoli diluizione AWF. Indigo carmine mostra una bassa assorbanza di resina a scambio cationico e pareti cellulari isolati e ha dimostrato di essere adatto per i calcoli AWF in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum e Glycine max 11,21,22. Tuttavia, in alcuni tipi di foglie, ad esempio, il riso e cetriolo, indigo carmine sembrava non essere pienamente recuperato dopo l'infiltrazione, che porterebbe ad una sottostima del fattore di diluizione AWF 12,21. La mancanza di recupero di indigotina può essere a causa della sua suscettibilità alle Decolleté in sulfonato Isatin dalla superossido 23, che è noto per essere prodotto nell'apoplasto, soprattutto sotto stress 24. Cleavage di indigotina in solfonato Isatin provocherà una perdita di assorbanza a 610 nm ed un aumento a 245 nm. Se questa reazione avviene in misura apprezzabile nell'apoplasto, o se questa reazione può essere inibita con l'aggiunta di decontaminanti superossido a infiltratfluido ion non è stato studiato fino ad oggi. Blu dextran è stato utilizzato al posto di indigotina per la quantificazione del fattore di diluizione AWF in riso lascia 12, anche se non è stata segnalata la sua stabilità e il recupero in AWF. In alternativa, i composti radiomarcati come [14 C] sorbitolo o altri standard interni quantificabili possono essere utilizzati al posto dei coloranti e la diminuzione della radioattività o della concentrazione misurata e utilizzata per calcolare il fattore di diluizione in modo analogo 11,14,25.

Limitazioni della tecnica

Esistono alcuni distinguo per il metodo di isolamento AWF infiltrazione-centrifugazione. In primo luogo, la diluizione del apoplast durante infiltrazione può ottenere una risposta dalla pianta. Se le cellule circostanti foglia rilevano una concentrazione minore per alcuni componenti del fluido apoplastico, possono rispondere espellendo ulteriori metaboliti, distorcendo l'interpretazione delle concentrazioni dei metaboliti. Inuna valutazione di questo problema si è osservato che né il tempo tra infiltrazione e centrifugazione né differenze moderate della forza ionica del fluido infiltrazioni influenzato la composizione del estratta AWF 14,22. Pertanto, eventuali manufatti derivanti da apoplast diluizione si pensa di essere il minimo.

Un secondo potenziale inconveniente è che eluizione di AWF per centrifugazione non cattura tutte le molecole presenti nell'apoplasto per diversi motivi. Alcuni composti, in particolare cationi e proteine ​​possono essere strettamente associati alla parete cellulare carico negativamente e non eluiscono con l'AWF 13. Altre molecole come le proteine ​​possono essere troppo grandi per eluire efficiente dal apoplast alle velocità di centrifugazione utilizzati 14. Le specie reattive dell'ossigeno sono un'importante classe di composti prodotti nell'apoplasto, ma a causa della natura di breve durata di questi composti, ed i requisiti specificati per la loro produzione, il loro presence non è ben catturata per estrazione AWF. Non è noto quanto accuratamente AWF rappresenta la composizione in vivo del fluido apoplast e puo variare tra le specie.

Diversi saggi esistono per stabilire la contaminazione citoplasmatica, anche se nessuno è universalmente accettata. Saggi di enzimi prevalentemente citoplasmatici (ad esempio, G6PDH, isomerasi esoso fosfati, MDH) hanno il vantaggio di essere facile da eseguire, ma non può correlare bene con perdite citoplasmatica 14,18. La valutazione dei metaboliti citoplasmatici (ad esempio, fosfati esosi, clorofilla) è forse più indicativo, ma è meno ben consolidata 11. Tuttavia, entrambi i tipi di test può essere utile per la quantificazione relativa di contaminazione apoplastica tra i campioni. Idealmente, più misurazioni indipendenti dovrebbero essere utilizzati per convalidare l'integrità del campione AWF.

Pur riconoscendo i suoi limiti, l'infiltrazione, centrifugatisulla tecnica qui descritta rimane una tecnica semplice e robusto nello studio di proteine ​​apoplastico, metaboliti primari e secondari e ioni inorganici.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Eppendorf Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22364111
razor blade Fisher 12-640 
60 ml syringe Becton Dickinson 300865
20 ml syringe Becton Dickinson 300613
4 inch parafilm Bemis PM-996
side arm flask SciLabware 12972831
vacuum source
5 ml pipette tips Fisher 50-813-28 
centrifuge Beckman Coulter 392932
Swinging bucket rotor Beckman Coulter 369702
indigo carmine Sigma I8130
microplate reader Tecan Infinite 200
96 well plates Becton Dickinson 353072
freeze dryer SciQuip Christ Alpha 2-4 LD
microcentrifuge biorad 166-0612EDU
oxaloacetic acid Sigma O4126
D-glucose-6-phosphate Sigma G7250
NADH Roche 10128023001
MDH assay kit Biovision K654-100
G6PDH assay kit Sigma MAK015-1KT
G-6-P assay kit Biovision K657-100
ribitol Sigma A5502
methanol Sigma 650471
chloroform Sigma 472476
vacuum concentrator Thermor Scientific SC250EXP
methoxyamine hydrochloride Sigma 226904
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide Sigma 394866
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Referenzen

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O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example. J. Vis. Exp. (94), e52113, doi:10.3791/52113 (2014).
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