A cóclea dos mamíferos é um órgão complexo altamente ordenada. No rato, entre o surgimento do ouvido interno primitivo da vesícula ótica no dia E11 e conclusão do programa de desenvolvimento em fases pós-natais, várias ondas de sinalização celular e mudanças coordenadas na expressão gênica ocorrem. Correndo de base para o ápice do ducto coclear é o som detectar epitélio sensorial, ou órgão de Corti. Desenvolvimento do órgão de Corti é primorosamente controlada de tal forma que até o final de desenvolvimento, ele será composto de uma única fileira de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas intercaladas com cinco fileiras de células de suporte (duas fileiras de células pilares, três linhas de células de Deiters ') ^1. Desvio dessa ordem resultados precisos em perda auditiva, heighlighting a importância de studye ofthe gênese e padronização do epithemlium sensorial ^2.

Cultivo in vitro da coch embrionárias de ratolea é uma ferramenta essencial para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento do órgão de Corti. Esta técnica foi estabelecido em 1974 e ao longo dos últimos 40 anos, tem sido utilizado para elucidar muitos dos mecanismos pelos quais o epitélio sensorial é especificado e o órgão de Corti estabelecidos ^3. A cóclea é um órgão complexo com processos de desenvolvimento dinâmicos; uma manipulação pode levar até sete dias para manifestar ^um. Por exemplo, quando a adição de inibidores de GSK 3β a uma cultura de explante da cóclea em E13, o período de incubação óptimo para observar um efeito robusto do que o composto é seis dias ^4.

Imagens ao vivo da cóclea desenvolvimento permite investigação sobre as mudanças na morfologia do órgão de Corti, mudanças na expressão gênica, acompanhamento de migração, proliferação ou células que morrem, e isso permite a observação em tempo real dos resultados dos agentes farmacêuticos e rompimento de sinalização percursos. Até agora, a imagem da cóclea viverfoi principalmente realizada usando microscopia confocal a imagem pequenas áreas do órgão de Corti ao longo de períodos de tempo curtos ^5-8, mas esta técnica tem limitações devido a viabilidade explante. Em imagiologia dos efeitos das manipulações de longo prazo sobre os processos de desenvolvimento lento, o ambiente de imagem é crucial. Normalmente, um sistema de imagem ao vivo confocal utiliza uma caixa de plástico umidificado que se senta no microscópio. O calor e humidade pode escapar através das aberturas na caixa de incubação onde se encontra com a tabela de microscópio, através das janelas de acesso, através das aberturas articuladas e através das lacunas em torno de várias partes do microscope- tais como o objectivo ou a fonte de luz. Este não é o ideal para a manutenção de explantes saudáveis ​​por mais do que dois ou três dias.

Nós definimos 'incubadora microscópio' como um microscópio invertido vedado dentro de uma incubadora de CO ₂ padrão, em vez de uma incubadora construído em torno do microscópio. Uma incubadora microscópio extende a vida do experimento de tal modo que, em vez de imagem ao longo de dois ou três dias, as amostras podem ser visualizados por até duas semanas. Um microscópio incubadora oferece um excelente ambiente para o crescimento e diferenciação celular, com o mínimo de perturbação explantar culturas e condições padrão controlado. Em estudos que têm lugar ao longo de vários dias, é comum recorrer a amostras de imagem numa base diária, removendo-os da incubadora e levando-as a um microscópio de fluorescência invertido. Embora essa abordagem possa funcionar, de retirar os pratos da incubadora inflige estresse sobre o tecido em desenvolvimento sensível. Mudanças na acidez do meio de cultura e as flutuações na temperatura devido à remoção da incubadora pode resultar em desenvolvimento abaixo do ideal e do tecido saudável. Imagiologia da mesma região no mesmo plano focal e com a mesma orientação em cada ponto de tempo é extremamente desafiador. Ao utilizar um sistema automatizado dentro de uma incubadora, é possível manter saudáveltecido, para recolher imagens em mais pontos de tempo e para assegurar que a mesma área seja capturado em cada quadro. Nos últimos anos têm sido desenvolvidas várias incubadoras microscópio de tecido integrados, estes têm sido úteis não só na prática clínica ^9, mas também em células estaminais e cancro da investigação ^10,11.

Aqui apresentamos um protocolo para criação de imagens ao vivo de longo prazo de explantes embrionárias de rato cocleares. Usamos um sistema de microscopia automatizada dentro de uma incubadora de CO ₂ padrão que tem a capacidade de capturar imagens de várias amostras em pontos de tempo definido. O sistema consiste de um microscópio invertido definido dentro de uma incubadora. As amostras são colocadas num estrado rotativo que permite imagens de múltiplas amostras em cada ponto de tempo. Iluminação, captura de imagem e rotação do estrado são controlados por um sistema automatizado operado através de software Metamorph. Ao definir uma rotina de imagem usando o software operacional, podemos definir um experimento para funcionar por até twO semanas com mínima intervenção humana. Neste exemplo, vamos usar tanto de campo claro e fluorescência para mostrar crescimento em larga escala e rearranjo da cóclea e, especificamente, a região prosensory. Neste experimento, cóclea serão dissecados de ratos repórter Sox2 ^EGFP no dia embrionário E13. Será estabelecida culturas in vitro e depois trabalhada ao longo de cinco dias.