Den däggdjurs snäckan är en mycket beställt komplext organ. I musen, mellan framväxten av den primitiva innerörat från öron vesikler på dag E11 och slutförande av utvecklings programmet vid första tiden efter födseln, flera vågor av cellsignalering och samordnade förändringar i genuttryck sker. Köra från bas till spets cochlea kanalen är ljudet upptäcka sensoriska epitel, eller organ Corti. Utveckling av organ Corti är utsökt kontrolleras så att i slutet av utvecklingen kommer det att bestå av en enda rad av inre hårceller, tre rader av yttre hårceller varvas med fem rader av stödjande celler (två rader av pelare celler, tre rader av Deiters 'celler) ^1. Avvikelse från detta exakta order medför hörselnedsättning, heighlighting vikten av studye FATTAT uppkomst och mönstring av den sensoriska epithemlium ^2.

In vitro odling av embryonala musen cochlea är ett viktigt verktyg för att studera mekanismerna för utvecklingen av organ Corti. Denna teknik grundades 1974 och under de senaste 40 åren, har använts för att belysa många av de mekanismer genom vilka den sensoriska epitelet specificeras och Cortis organ etablerade ^3. Snäckan är ett komplext organ med dynamiska utvecklingsprocesser; en manipulation kan ta så länge som sju dagar att manifestera ^1. Till exempel, när man lägger till GSK 3β inhibitorer till ett cochlea explantatet kulturen vid E13, den optimala inkubationstiden för att observera en stark effekt av föreningen är sex dagar ^4.

Live avbildning av utvecklings snäckan medger undersökning förändringar i morfologi Cortis organ, förändringar i genuttryck, spårning av migrerande, förökar eller döende celler, och det tillåter realtid observation av resultaten av farmaceutiska medel och störning av signalering vägar. Hittills levande avbildning av snäckanhar främst utförts med hjälp av konfokalmikroskopi att avbilda små områden av Cortis organ under korta tidsperioder ^5-8, men denna teknik har begränsningar på grund av explant livskraft. I avbildning av effekterna av långsiktiga manipulationer på långsamma utvecklingsprocesser, är bildmiljön avgörande. Typiskt en konfokala Bildproduktion system använder en fuktig plastlåda som sitter på mikroskopet. Värme och fukt kan komma ut genom luckorna i inkubation rutan där den möter mikroskopbordet, genom access fönstren, genom de svängbara öppningar och genom luckor runt olika delar av microscope- såsom målet eller ljuskällan. Detta är inte optimalt för en hälsosam explantat i mer än två eller tre dagar.

Vi definierar "kuvös mikroskop" som ett inverterat mikroskop förseglat inne i en standard _CO2 inkubator, snarare än en inkubator byggd runt mikroskopet. En inkubator mikroskop extenderar livet av experimentet så att i stället för avbildning under två eller tre dagar, kan prover avbildas i upp till två veckor. En inkubator mikroskop ger en utmärkt miljö för celltillväxt och differentiering, med minimal störning till explantation kulturer och standardkontrollerade betingelser. I studier som sker över flera dagar är det vanligt att ta till avbildnings prover dagligen genom att ta bort dem från inkubatorn och transporterar dem till ett inverterat fluorescensmikroskop. Detta förhållningssätt kan arbeta, ta bort disken från inkubatorn fogar stress på känsliga utveckla vävnaden. Förändringar i surhetsgrad odlingsmediet och svängningar i temperaturen på grund av avlägsnande från inkubatorn kan resultera i suboptimal utveckling och ohälsosamt vävnad. Avbildning av samma region vid samma fokalplan och i samma orientering vid varje tidpunkt är extremt utmanande. Genom att använda ett automatiserat system inom en inkubator, är det möjligt att bevara friskavävnad, för att samla in bilderna vid flera tidpunkter och för att säkerställa att samma område fångas i varje ram. Under senare år har flera integrerade mikroskop vävnads inkubatorer har utvecklats, dessa har varit till nytta, inte bara i klinisk praxis ⁹ men också i stamcells och cancerforskning ^10,11.

Här presenterar vi ett protokoll för långsiktig levande avbildning av embryonala mus cochlea explants. Vi använder en automatiserad mikroskope-system i en vanlig _CO2 inkubator som har förmågan att ta bilder av flera prover vid inställda tidpunkter. Systemet består av ett inverterat mikroskop inställd inuti en inkubator. Proverna placeras i en roterande podium som tillåter avbildning av multipla prover vid varje tidpunkt. Belysning, bildfångst, och rotation av podiet styrs av ett automatiserat system drivs genom metamorfa programvara. Genom att sätta en avbildningsrutin med hjälp av operatörsprogrammet kan vi ställa ett experiment för att köra upp till two veckor med minimal mänsklig inblandning. I det här exemplet använder vi både ljusa fält och fluorescens för att visa storskalig tillväxt och omarrangemang av snäckan, och specifikt prosensory regionen. I detta experiment kommer hörselsnäckor dissekeras från Sox2 ^EGFP reporter möss på embryonala dag E13. In vitro kulturer kommer att upprättas och sedan avbildas under fem dagar.