השבלול של היונקים הוא איבר מורכב הורה מאוד. בעכבר, בין הופעתה של האוזן הפנימית הפרימיטיבית משלפוחית ​​otic ביום E11 והשלמת התכנית התפתחותית בשלבי לידה מוקדמים, גלים רבים של איתות תא ושינויים מתואמים בביטוי גנים יתקיימו. פועל מבסיס לקודקוד צינור השבלול הוא הצליל זיהוי האפיתל חושית, או איבר של קורטי. פיתוח של האיבר של קורטי נשלט להפליא כך שעד סוף הפיתוח, זה יהיה מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים, שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים וביניהם חמש שורות של תאי תומכים (שתי שורות של תאי עמוד, שלוש שורות של התאים 'Deiters) ^1. סטייה מתוצאות סדר המדויקת הזה בירידה בשמיעה, heighlighting חשיבות studye הצטברו בראשית ודפוסים של epithemlium החושי ^2.

בתרבית במבחנה של coch העכבר העוברילאה היא כלי חיוני בחקר המנגנונים של התפתחות של האיבר של קורטי. טכניקה זו הוקמה בשנת 1974 ובמשך 40 השנים האחרונות, נעשתה שימוש כדי להבהיר רבים מהמנגנונים שבאמצעותם האפיתל החושית מצוינת והאיבר של הקורט הוקמו ^3. השבלול הוא איבר מורכב עם תהליכים התפתחותיים דינמיים; מניפולציה עשויה להימשך עוד כשבעה ימים כדי להגשים ^1. לדוגמא, בעת הוספת מעכבי 3β GSK לתרבות explant שבלול בE13, תקופת הדגירה האופטימלית להתבונן השפעה חזקה של המתחם היא שישה ימים ^4.

הדמיה חיה של שבלול הפיתוח מאפשרת חקירת שינויים במורפולוגיה של האיבר של קורטי, שינויים בביטוי גנים, מעקב נודד, מתרבים או למות תאים, וזה מאפשר התבוננות בזמן אמת של התוצאות של סוכני תרופות ושיבוש האיתות מסלולים. עד עכשיו, לחיות הדמיה של השבלולבעיקר שבוצע באמצעות מיקרוסקופ confocal לאזורים קטנים תמונה של האיבר של קורטי על פני תקופות זמן קצרות ^5-8, אבל טכניקה זו יש מגבלות בשל כדאיות explant. בהדמיה של ההשפעות של מניפולציות לטווח ארוך יותר על תהליכים ההתפתחותיים איטיים, סביבת ההדמיה היא קריטית. בדרך כלל מערכת הדמיה חיה confocal משתמשת קופסא פלסטיק humidified שיושב על המיקרוסקופ. חום ולחות יכולים לברוח דרך הפערים בתיבה דוגרות במפגש שולחן מיקרוסקופ, דרך חלונות הגישה, דרך פתחי צירים ודרך הפערים סביב חלקים שונים של microscope- כגון אובייקטיבי או מקור האור. זה לא אופטימלי לשמירת explants הבריא יותר מימים או שלוש.

אנו מגדירים "מיקרוסקופ חממה 'כמיקרוסקופ הפוכה אטומה בתוך CO ₂ באינקובטור סטנדרטי, ולא חממה שנבנתה סביב מיקרוסקופ. לשעבר מיקרוסקופ החממהנוטה החיים של הניסוי כזה שלא הדמיה על שניים או שלושה ימים, ניתן הדמיה דגימות לתקופה של עד שבועיים. מיקרוסקופ חממה מספק סביבה מצוינת לצמיחה והתמיינות של תאים, עם הפרעה מינימאלית לexplant תרבויות ותנאים סטנדרטיים מבוקר. במחקרים שיתקיימו במשך ימים רבים זה מקובל לפנות לדגימות הדמיה על בסיס יומי על ידי הוצאתם מהחממה ונשא אותם למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בעוד גישה זו יכולה לעבוד, הסרת המנות מהחממה גורמת ללחץ על רקמת הפיתוח רגישה. שינויים בחומציות של מדיום התרבית ותנודות טמפרטורה בשל ההסרה מן החממה יכולים לגרום להתפתחות תת אופטימלית ורקמות בריאים. הדמיה באותו האזור באותו מישור המוקד ובאותו כיוון בכל נקודת זמן היא מאוד מאתגרת. על ידי שימוש במערכת אוטומטית בתוך חממה, ניתן לשמור על בריאותרקמה, כדי לאסוף תמונות הנמצאות בנקודתי זמן ולהבטיח כי אותו האזור שנתפס בכל מסגרת. בשנים האחרונות כמה חממות רקמת מיקרוסקופ משולבות פותחו, אלה היו שימושיים לא רק בפרקטיקה קלינית ⁹ אלא גם בתאי גזע וסרטן מחקר ^10,11.

כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה לחיות לטווח הארוך של explants שבלול עכבר העוברי. אנו משתמשים במערכת מיקרוסקופיה אוטומטית בתוך חממת CO ₂ סטנדרטית שיש לו את היכולת ללכוד תמונות של דגימות מרובות בנקודות זמן מוגדר. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ הפוך להגדיר בתוך חממה. דגימות ממוקמות בבמה מסתובבת המאפשרת הדמיה של דגימות מרובות בכל נקודת זמן. תאורה, לכידת תמונה, והסיבוב של הבמה נשלטות על ידי מערכת אוטומטית המופעלת באמצעות תוכנת Metamorph. על ידי הגדרה שגרתית הדמיה באמצעות תוכנת ההפעלה אנו יכולים להגדיר ניסוי כדי לרוץ עד TWשבועות o עם התערבות אנושית מינימאלית. בדוגמא זו אנו משתמשים הן שדה הקרינה בהירים להציג צמיחה בקנה מידה גדולה וסידור מחדש של השבלול, ובאופן ספציפי, באזור prosensory. בניסוי זה, cochleae יהיה גזור מעכברי כתב Sox2 ^EGFP ביום עוברי E13. תרבויות במבחנה תוקמנה ולאחר מכן צילם במשך חמישה ימים.