망막 색소 상피 세포에 탐식 분석 실험에 대한 돼지 또는 소 광 수용체 외부 세그먼트의 대규모 정화
Summary
This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 °C.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE) 세포, 감광체 외측 세그먼트 (POS)의 소비 세 말단 단편의 탐식 중요한 기능 중 하나의 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. phototransduction 기계를 포함하는 멤브레인 디스크의 스택과 함께 광 수용체 외부 세그먼트는 지속적으로 망막에 갱신됩니다. 소비 POS는 망막 색소 상피 세포에 의해 매일 제거된다. 설치류, 돼지 / 소 및 인간 RPE 세포는 유사한 방식으로 다양한 종으로부터 POS 인식. 작은 변동으로 큰 시리즈의 실험을 수행하는 것을 용이하게하기 위해, POS의 큰 눈 스톡은 돼지로부터 분리 및 분취 냉동 저장 될 수있다. 이 프로토콜은 어두운 곳에서 보관시 오렌지색 표시 photopigments의 특성을 이용한다. 희미한 붉은 빛에서 절반으로 잘라 열 eyecups에서 버퍼에 망막 수집됩니다. 망막 세포 현탁액을 균질화 연속 수크로오스 구배 상으로 여과시키고로드된다. CEN 후trifugation는 POS는 오렌지 색상 특성을 갖는 그래디언트의 상단부에 개별 대역에 위치한다. POS는 다음 수집, 회전, 세척 버퍼에 순차적으로 재현 탁, 카운트 분주합니다. 이 방법으로 얻어진 POS 식세포 작용 분석 및 POS 도전 후 다양한 시점에서의 단백질 활성 지역화 또는 상호 작용의 분석에 이용 될 수있다. 또한, POS는 전자. 형광 물질로 표시 할 수 g., FITC, 이후의 형광 결합 POS의 정량 또는 말림을 위해, 분취 전에. 다른 가능한 애플리케이션은 산화 스트레스 또는 RPE 세포에 대한 노화의 효과를 연구하기 위해 스트레스 조건과 결합 된 변성 또는 POS POS 도전 사용을 포함한다.
Introduction
망막, 시력은 뇌의 시각 영역까지 뉴런 사이에서 전송 될 수있는 신호로 변환되기 전에, 감광성 opsins 불리는 분자의 이성화에 의해 트리거된다. 이들 분자는 시각 세포의 외부 세그먼트 부 PRS ()를 구성 팬케이크 닮은 멤브레인 디스크 스택에 포함된다. 빛과 산화 스트레스 때문에 상당한 수준으로 일정하게 노출 실시한, 푸에르토 리코 놈들은 지속적으로 잠재적 인 산화 적 손상을 제한하기 위해 자신의 외부 세그먼트를 갱신. 감광체 외부 세그먼트는 인접하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 미세 융모 꼭대기에 밀착된다. RPE 세포는 혈액 망막 장벽의 외측 부분을 구성하며, 이러한 멜라닌 색소, 광 반응성 옵신 성분 망막 재 이성화 제공 영양분 g 통해 광선 담금질 감광체 건강과 기능 1에 중요한 수많은 작업을 보장홍보 대사 처리에 참여하는 요인을 rowth.
또한, RPE 세포는 POS를 보냈다 및 구성 요소, 포유류 망막 2,3의 일주기 리듬에 의해 조절된다 매일 직업을 재활용 제거합니다. 창고 POS의 간격은 PR 생존에 절대적으로 필요하다. 이 완전히 폐기 될 때, POS 파편 축적 PRs를 급속 시력 손실을 야기 4,5- 퇴화. 리듬 프로필이 손실 일정한 활동으로 대체하는 경우, PR 및 RPE 결함은 6 세에 축적된다. 따라서, 해당 장애에 링크 표현형을 이해하기 위해서는 시험관 내에서 RPE 탐식의 분자 특성을 조절하는 것이 매우 중요하다. 흥미롭게도, 망막 색소 상피 세포에서 분자 기계는 세포 사멸을 취소 식세포에서 사용하는 것과 매우 유사하며, 모두 식세포 파편 7-9에 노출 된 포스파티딜 세린의 인식에 따라 달라집니다. 그러나 망막 색소 상피 세포와 대 식세포는 산도를 조절대 식세포는 만남시 사멸 세포의 즉각적인 제거에 대한 선택으로 agocytosis는 다르게, 망막 색소 상피 세포는 리듬 외부 세그먼트 영구 접촉에도 불구하고 하루에 한 번만 POS를 침몰한다. 이것은 아직 완전히 이해되지 않는 특정 규제 메커니즘을 제안한다.
망막 색소 상피 식세포 기계에 연루 분자의 대부분은 확인 또는 격리 된 POS 및 세포 배양 식세포 작용 분석의 사용 덕분에 확인되었다. 리간드 MFG-E8와 협응 혀끝 RPE 세포 표면에 위치 alphavbeta5 인테그린 수용체는 다음 MerTK 티로신 키나제 수용체를 통해 내부화되는 13-15 POS 10-12에 특이 적으로 결합. 소제 CD36 수용체 POS 섭취에 참여하고 그 속도 (16, 17)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, POS면 (18)에서 산화 인지질의 센서로서 기능 할 수 있습니다. 국제화는 F-액틴 세포 골격 엉덩이의 채용이 필요이러한 넥신 2 (19), 미오신 II (20)과 미오신 VIIA 21, 22로 ociated 단백질. 체외에서 기본 또는 산화 POS도 제대로 소화 산화 POS 23-28의 축적에 연결된 생체 내에서 망막 색소 상피 세포의 노화 표현형을 이해하기 위해 사용된다. 줄기 세포 유래의 RPE 세포의 생성은 동물이나 환자 29,30,27 이식 전에 세포 기능을 증명하기 위해 사용되는 절연 POS 용의 애플리케이션을 개시하고있다.
먼저 1987 31 Molday와 동료에 의해 기술, 소 POS의 분리를위한 프로토콜 (11- 시스 망막을 운반) 표백 망막 photopigment의 특성 오렌지 모양의 관찰 연속 자당 그라디언트에 망막 균질의 초 원심 분리 단계를 결합합니다. 지난 10 년에 광우병의 위험을 최소화하기 위해 취해진 조치에 의한은 돼지의 사용은 눈 increasi되었다ngly 눈에 띄는. 여기에 설명 된 프로토콜은 돼지 또는 분주 장시간 동안 저장 될 수 소의 눈에서 POS 다량 획득하는 방법을 보여준다. 이 POS 준비 및 분석 32,33,21,22 당 동물의 다수 사용해야 쥐 눈에서 POS를 준비 할 필요를 없애 준다. 또한, 형광 분자를 사용하여 저장하기 전에 POS 라벨에 대한 자세한 내용은 정량화 식균 작용 분석 32, 10 후 라벨 POS에 비해 일부 응용 프로그램에 대한 간단하고 비슷한 방식으로 POS를 시각화하기 위해 제공됩니다. 따라서,이 물량은 큰 실험의 다양한 종류의 재현성 및 사용의 용이성을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세 단계 또는 조건이 최적화 된 정제에 매우 중요하다 : 그라데이션 주조 섬세한 그라데이션 튜브 조작의 품질, 냉장 및 수집 단계까지 어둠 속에서 조직을 유지, 망막 균질의 흔들림의 강도는 PR의 나머지 부분에서 적절한 POS 격리을 얻었다 세포. 몇 가지 문제가 제대로 오렌지 대역을 보는 발생할 경우, 인해 상기 세 가지 이유 중 하나 (도 결과 섹션의 두 번째 단락 참조) 가장 가능성…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 직원은 국립 드 라 공들인 (Jeunes Chercheuses / EFN에 Jeunes Chercheurs), 파운데이션 VOIR 등 Entendre과 파운데이션 Bettencourt SCHUELLER (EFN에 젊은 연구자 지원 사업), 센터 국립 드 라 과학원 (CNRS, EFN에 대한 영구적 인 위치)에 의해 지원되었다 및 (SCF에 R01-EY13295) 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소. 또한, 문화원 드 라 비전은 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE, 대학 학자 피에르 등의 마리 퀴리 – 파리 6, 센터 국립 드 라 과학원과 부서 드 파리 재정 지원된다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2-chamber gradient maker | gradient maker with 30-ml chambers | ||
| 3-mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| small size magnetic stir bar | stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| red safelight lamp | inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25×89 cm tubes | Beckman | 344058 | ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30-mL centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| dark ice buckets with lids | |||
| scales | |||
| magnetic stirrer and upholding pole | |||
| refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| labcoat | Health and safety | ||
| gloves | |||
| sleeve protectors | |||
| googles | |||
| absorbent pads | |||
| biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades (60-mm/2.25-in wide razor blades) | Dissection | ||
| 15-cm plastic dish | |||
| sterile gauze sheets | |||
| 15- and 50-mL tubes | Common consumables | ||
| microtubes | |||
| aluminum foil | |||
Referenzen
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