Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen

In de retina, wordt zicht veroorzaakt door isomerisatie van fotogevoelige moleculen genaamd opsins, alvorens te worden omgezet in een signaal dat tussen neuronen kunnen worden doorgegeven aan de visuele gebieden van de hersenen. Deze moleculen zijn ingebed in stapels van membraneuze schijven lijkt op pannenkoeken dat de buitenste segment delen van lichtgevoelige cellen (PV's) vormen. Worden onderworpen aan een constante blootstelling aan licht en dus een aanzienlijke mate van oxidatieve stress, continu PR's hun buitenste segmenten te vernieuwen om mogelijke oxidatieve schade te beperken. Fotoreceptor buitenste segmenten staan ​​in nauw contact met de apicale microvilli van het naburige retinale pigment epitheel (RPE) cellen. RPE-cellen vormen het buitenste gedeelte van de bloed-retina barrière en zorgen talrijke taken die cruciaal zijn voor fotoreceptoren gezondheid en functie ¹ zijn, zoals afschrikken lichtstralen via melanine, opnieuw isomerisatie van de fotoreactieve opsin component retinal verstrekken van voedingsstoffen en gGROEI factoren, deelnemen aan PR metaboliet beschikking.

Bovendien elimineren RPE cellen besteed POS en hun componenten, een dagelijkse bezigheid die wordt gereguleerd door het circadiane ritme in zoogdierretina ^2,3 recyclen. De klaring van loods POS is absoluut noodzakelijk voor PR overleven. Wanneer deze volledig is ingetrokken, POS vuil ophopen en PR's ontaarden dat een snel verlies van het gezichtsvermogen ^4,5. Als de ritmische profiel verloren en vervangen door een constante activiteit, PR en RPE gebreken accumuleren ⁶ leeftijd. Daarom is het erg belangrijk om de moleculaire regulatie van RPE fagocytose karakteriseren in vitro om fenotypen verbonden met de dysfunctie begrijpen. Interessant is dat de moleculaire machinerie van RPE cellen vergelijkbaar met die gebruikt door macrofagen apoptotische cellen wissen en beide zijn afhankelijk erkenning van blootgestelde fosfatidylserine op fagocyterende vuil ^7-9. Toch RPE cellen en macrofagen reguleren phagocytosis anders macrofagen kiezen voor onmiddellijke verwijdering van apoptotische cellen bij ontmoeting moment tijdens RPE cellen ritmisch overspoelen POS eenmaal daags ondanks hun permanent contact met de buitensegmenten. Dit suggereert specifieke mechanismen regelgeving die nog niet volledig begrepen.

Veel moleculen betrokken bij het RPE fagocytaire machine geïdentificeerd of gevalideerd door het gebruik van geïsoleerde POS en celcultuur fagocytose assays. De alphavbeta5 integrine receptor bij het ​​RPE apicale celoppervlak, in samenwerking met zijn ligand MFG-E8, bindt specifiek aan POS ^10-12, die vervolgens worden geïnternaliseerd via MerTK tyrosine kinase receptor ^13-15. De CD36 scavenger receptor werd aangetoond dat POS inname en beïnvloeden de snelheid ^16,17 en kan dienen als een sensor van geoxideerde fosfolipiden op het POS vlak ^18. Internalisatie moet de werving van F-actine cytoskelet-associated eiwitten zoals annexine 2 ^19, myosine II ²⁰ en myosine VIIA ^21,22. Inheemse of geoxideerd POS in vitro worden ook gebruikt om veroudering fenotypes van RPE cellen in vivo gekoppeld aan accumulatie van slecht verteerd geoxideerde POS ^23-28 begrijpen. Het genereren van RPE cellen afkomstig van stamcellen is een nieuwe toepassing voor geïsoleerde POS die worden gebruikt om de functies van cellen bewijzen voordat ze worden getransplanteerd dieren of patiënten ^29,30,27 geïnitieerd.

Eerst beschreven door Molday en collega's in 1987 ^31, het protocol voor isolatie van runderen POS combineert een ultracentrifuge stap van retinale homogenaten op continue sucrosegradiënten met observatie van de karakteristieke oranje uiterlijk van ongebleekt retinale photopigment (uitvoeren 11- cis retinal). In de afgelopen 10 jaar, als gevolg van voorzorgsmaatregelen genomen om het risico van de gekkekoeienziekte te minimaliseren, het gebruik van varkens ogen is geworden increasingly prominent. De hier beschreven protocol duidelijk dat grote hoeveelheden POS van varkens of runderen ogen die kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen voor langere tijd te verkrijgen. Dit elimineert de noodzaak om POS bereiden van knaagdieren ogen, die vereist het gebruik van een groot aantal dieren per POS voorbereiding en test ^32,33,21,22. Daarnaast worden gegevens over POS labeling vóór opslag met fluorescerende moleculen gegeven, te kwantificeren en visualiseren POS in een vereenvoudigde en vergelijkbare wijze voor sommige toepassingen tegenover etikettering POS na fagocytose assay ^32,10. Daarom zijn deze grote voorraden zorgen voor reproduceerbaarheid en gebruiksgemak in vele verschillende experimenten.