The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
Конец 1970-х увидел первый публично сообщил использования вестерн, методики для оценки присутствия и относительное обилие специфических белков внутри сложных биологических образцов. С тех пор, западная блоттинга методология стала общим компонентом в молекулярных биологов экспериментальной репертуара. Беглый поиск PubMed использовать термин "Вестерн-блот" предполагает, что сверх 220 000 опубликованных рукописей сделали использование этой техники в 2014 году главное, за последние десять лет наблюдается технические достижения визуализации в сочетании с развитием чувствительных флуоресцентные метки, которые улучшили чувствительность и принес еще большую диапазоны линейного обнаружения. В результате в настоящее время по-настоящему Количественное флуоресценции основе Вестернблоттинг (QFWB), что позволяет биологам провести сравнительный анализ экспрессии с большей чувствительностью и точностью, чем когда-либо прежде. Многие "оптимизированы" Вестерн-блоттингаМетодологии существуют и используются в различных лабораторий. Они часто оказываются трудно реализовать из-за требования тонких, но без документов процедурных изменений. Этот протокол обеспечивает всестороннее описание установленной и надежный метод QFWB, в комплекте с стратегий по устранению неполадок.
Вестерн-блоттинг (WB) является аналитический метод, первоначально разработана в конце 1970-х годов, чтобы определить наличие или отсутствие интересующего белка в сложной биологической пробе, такой как гомогената ткани 1. Обычно называют белкового иммуноблоттинга, из-за ключевого взаимодействия антитело-антиген, методика состоит из 5 различных этапов: 1) электрофоретического разделения белков по их изоэлектрической точке; 2) передача на нитроцеллюлозный или поливинилидендифторид (PVDF) мембраны; 3) маркировки с использованием первичного антитела, специфичного к интересующего белка; 4) инкубацию со вторичным антителом, направленным против первичного антитела; и 5) визуализация.
Методология Визуализация превратилась со временем повышения безопасности и чувствительность. Некоторые из первых WBS проводились с использованием меченых радио меток, которые затем продвинулись на колориметрический а затем более широко используются методы chemilluminescent (ECL). Radioactiviти непосредственно помечены на зондов для специфических антигенов в то время как колориметрические и ECL методологии использовать косвенную технологии маркировки с ферментом репортера, например, щелочной фосфатазы или стрептавидин пероксидазы хрена (HRP) 2. Интенсивность мечения хромоген или люминесцентного продукта измеряется с помощью денситометрии в результате чего мощность сигнала, сильным или слабым, указывает более или менее присутствие интересующего белка в образце. ECL является более чувствительным, и поэтому выступает методология 2, но все 3 метода были изначально разработаны на рентгеновской пленке с более изощренных методов цифровой обработки изображений впоследствии установленных 3. Продвижение цифровых изображений ВБ не только позволил исследователю, чтобы определить наличие или отсутствие их интерес белка, но также позволил вывод на уровне экспрессии выбранного белка по сравнению с другими образцами и, следовательно, могут быть отнесены к "полуколичественная & #8221 ;. В последнее время, действительно количественный и более чувствительны вестерн-блоттинга технология была разработана в результате чего уровень флуоресценции измеряется непосредственно связана с количеством и экспрессии одного белка в образце: количественный флуоресцентное вестерн-блоттинга (QFWB).
При сравнении с QFWB ECL маркировки, использование флуоресцентной вторичного антитела генерирует линейный профиль обнаружения 4. Это в отличие от методик ECL, где сигнал линейность как правило, происходит при низких нагрузках белка ниже 5 мкг и насыщения сигнала, непосредственно связанных с экспрессии белка, то есть, с повсеместно экспрессируемых генов домашнего хозяйства 5,6. Это несоответствие, скорее всего, обусловлено большим числом сайтов связывания для авидин ECL субстрата связывается с биотинилированным вторичным, приводит к более высокой вероятности потенциального насыщения сигнала. Это является одной из основных причин ECL базовой иммуноблоттинга именуются ONLу "полуколичественная" 7. Точка насыщения сигнала имеет решающее значение при измерении тонкие различия в уровне экспрессии и может привести к неточным измерениям. В последние годы с появлением распространенных протеомическим методов, подробно все большее чувствительность и идентификацию тонких различий экспрессии привело к все возрастающей зависимостью от действительно количественного вестерн-блоттинга для экспериментов валидации 8,9. Применение чувствительной, надежной и действительно количественного методологии Поэтому крайне важно.
Многие "оптимизированные" вестерн-блоттинга методологии были использованы независимыми лабораториями, которые часто доказывают трудно установить или скопировать из-за тонких методологических корректировок, которые не могут быть очевидны в формальных документированных протоколов. Это установлено и надежный протокол для QFWB и дополнительно обеспечивает ценные стратегии для устранения общих проблем -гот может возникнуть в ходе реализации.
Этот протокол был первоначально оптимизирован для использования с мышиными гомогенатах мозга, но с тех пор были эффективно использованы в широком диапазоне образцов тканей и видов 4,9,10. Потенциальные изменения протокола, необходимые для конкретных вопросов по устранению неполадок входят.
Должное внимание и планирование имеет важное значение до любого эксперимента и может в конечном итоге определяют успех используемого метода. Достижения в области обнаружения белка, используя WB можно представить множество потенциальных камней преткновения при попытке выбрать соответствующие антитела, передача и визуализации методы использовать. К счастью, с помощью тщательного перечень и соответствующие меры контроля QFWB можно использовать регулярно, чтобы определить присутствие белков и более тонкие различия экспрессии между образцами. Этот протокол обеспечивает полное руководство по флуоресцентной количественной вестерн-блоттинга, а также несколько стратегий устранения неполадок, чтобы избежать и / или преодолеть некоторые из многих распространенных ошибок, связанных с ним.
Критические шаги, используемые для поддержания чувствительности и получить по-настоящему исчисляемая и сопоставимые измерения включают: 1) надежные экстракции белка из образцов тканей; 2) подготовка образца; 3) точный белок loadinг определяется общей анализа белков; 4) оптимальная передача белков с использованием I-блоттинга; 5) подготовка первичных и вторичных антител в блокирующем буфере, содержащем 0,1% Tween 20, и 6) правильно визуализации и анализа с использованием тепловизорный и соответствующее программное обеспечение.
Инфракрасная детекция флуоресцентного действительно количественный и обеспечивает большую чувствительность по сравнению с более традиционными ECL методов обнаружения 3,11. Эта система обнаружения разносторонняя, и как таковой не ограничивается QFWB. Эта система способна визуализации иммуногистологического маркировки на малой мощности, позволяя визуализацию и количественное определение секций цельной ткани 12. Это одна из областей потенциального развития будущего с точки зрения решения, которое можно было увидеть далеко красную изображений конкурируя обычную иммунофлюоресценции захват с обычными микроскопами с точки зрения количественной оценки.
Тем не менее, с большей чувствительности к незначительным изменениям в рrotein выражение это имеет решающее значение для обеспечения изменчивости сохраняется до минимума и контрольных мер являются строгими с надежными протоколами. Это начинается с тщательного извлечения белка из образца ткани с последующей продукции общего белка окрашивали гелей, чтобы обеспечить уверенность в том, что образец нагрузка равномерна, оптимизация первичных и вторичных антител, чтобы определить, если обнаружение реальной и тестирование принципы изготовителя в отношении передачи раз, чтобы получить эффективную передачу белка.
Тем не менее, даже тогда, когда условия для ВБ оптимизированы, может еще проблемы, связанные с управлением вестерны, что, возможно, не до конца изучены здесь. Они включают, но не ограничиваются ими, в том числе факторов белковой солюбилизации и выбора экстракционного буфера. Некоторые буферы могут мешать концентрации белка анализов, и некоторые ткани особенно трудно растворить, требующих более надежные методы, такие как использование автоматизированной maceraка герметично контейнеры, такие как M труб вместе с диссоциатора Macs. Кроме того, простые меры по контролю за хранение извлечены и не добытого материала при -80 ° С может быть разница между получения оптимального маркировки непосредственно после экстракции и имеющие плохие результаты недели спустя.
Современные методы QFWB которые оказались более чувствительны для захвата тонкие различия в экспрессии белка и более универсальным позволяя одновременно двойную маркировку 3 по сравнению с более старыми методами, такими как ECL. Очень важно, чтобы западные протоколы блоттинга являются надежными и легко повторяемые для точной количественной и статистического анализа. Этот протокол является чувствительным и достаточно прочным, чтобы быть использован обычно применяемый для обнаружения белков в различных образцах тканей различных видов и 3 и позволяет количественно определить низких и высоких белков численности в пределах одной и той же самым уменьшая QFWB расходом расходных а также раз в эксперименте 1. 1 Кроме того, повышенная чувствительность этого метода позволяет проверку все более популярным – OMIC исследования 9,14, однако точность имеет решающее значение и включение соответствующих мер контроля должны соблюдаться таким образом избегая ошибочных сбора данных.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы, чтобы благодаря следующее за финансовую поддержку: BBSRC институт Стратегическая программа финансирования – CF & TMW; BBSRC Восток Bio DTP финансирование – LG; Дарвин Trust Эдинбурга – MLH. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Барри Макколл для разрешения включить оптимизацию TREM2 в этой рукописи.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |