Visualisation non-lytique exocytose de<em> Cryptococcus neoformans</em> À partir de macrophages au moyen de Digital microscopie optique
Summary
Nous décrivons comment visualiser macrophages C. neoformans (Cn) les interactions en temps réel, avec un accent particulier sur le processus d'exocytose non lytique en utilisant la microscopie numérique de la lumière. En utilisant cette technique individuellement macrophages infectés peuvent être étudiées pour déterminer différents aspects du phénomène.
Abstract
De nombreux aspects de l'infection des macrophages par Cryptococcus neoformans ont été largement étudiés et bien défini. Cependant, une interaction particulière qui n'est pas clairement comprise exocytose est non lytique. Dans ce procédé, des cellules de levure sont libérés dans l'espace extracellulaire par un mécanisme mal compris que les deux feuilles et le macrophage Cn viable. Ici, nous décrivons comment suivre un grand nombre de macrophages infectés individuellement pendant une période de 24 heures de l'infection par microscopie de temps écoulé. Macrophages infectés sont logés dans une chambre de chauffage avec une atmosphère de CO 2 fixé à un microscope qui offre les mêmes conditions qu'un incubateur de culture cellulaire. Microscopie numérique en direct peut fournir des informations sur les interactions dynamiques entre un hôte et l'agent pathogène qui n'est pas disponible à partir d'images statiques. Être capable de visualiser chaque cellule infectée peut fournir des indices sur la façon dont les macrophages traitent les infections fongiques, et vice versa. Cette technique isa un outil puissant dans l'étude de la dynamique qui se trouvent derrière un phénomène complexe.
Introduction
Les étapes d'une infection fongique entre les cellules et les macrophages cryptococcose sont bien documentés 1-3. Après que les cellules de levure sont ingérés par les macrophages, une variété d'interactions peuvent se produire: le macrophage peut lyser libérer sa charge fongique dans l'espace extracellulaire, ou il peut contrôler l'infection par le maintien des cellules de levure dans les limites de sa membrane cellulaire 4. Cependant, il ya quelques années, un nouveau résultat a été décrit de façon indépendante par deux groupes: exocytose non lytique, un processus dans lequel un macrophage radié partie ou la totalité des cellules cryptococcose dans l'environnement ou une cellule voisine et à la fois l'hôte et l'agent pathogène restent viables 5 -8. Plusieurs études ont tenté de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cette interaction, mais nous n'avons pas encore une compréhension complète sur ce qui motive ce phénomène.
La capacité de capturer des images en temps réel et d'analyser ensuite infecter multiplesed macrophages permet de répondre à de nombreuses questions sur les propriétés physiques entourant l'exocytose non lytique en ce qui concerne le calendrier, la capacité spatiale, le changement dans la morphologie et même le stress des macrophages lors d'une infection fongique. En permettant aux cellules d'être logés dans un environnement qui est comparable à celle d'un incubateur, on peut apercevoir la nature dynamique de l'interaction de cellules macrophages-fongique. Les chercheurs ont utilisé cette technique pour étudier les différentes composantes de ce processus. Le rôle du phagosome dans ce processus a été rendu évident en utilisant une coloration fluorescente et l'actine agents de blocage 9, tandis qu'un autre groupe a utilisé cette méthode pour montrer que l'exocytose non lytique a été bloqué dans les cellules qui ont eu le WASH nucléation des domaines protéiques supprimé 10. L'effet de la signalisation de cytokine a aussi été constatée en utilisant la microscopie en temps réel 11. Ce procédé n'est pas limité à C. neoformans comme il a également été observée avec Candida albicans, another pathogène fongique qui a la capacité d'infecter les macrophages 12. Ces résultats sont des exemples de la façon dont cette méthode peut fournir une mine d'informations pour une région que nous connaissons si peu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode par laquelle les interactions fongiques macrophages peuvent être enregistrées et analysées en temps réel sur une période de 24 heures. Notre laboratoire a utilisé ce protocole pour étudier de nombreux aspects temporels de l'exocytose non lytique et continuera d'utiliser la microscopie en temps réel pour déterminer les composants morphologiques qui entourent ce processus.
Pour cette technique pour obtenir des résultats optimaux, une atten…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par NIH prix 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
Referenzen
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
