Summary

Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw

Published: October 08, 2014
doi:

Summary

Cochleair implantaat (CI) in staat stellen het horen door directe elektrische stimulatie van de gehoorzenuw. Echter, slechte frequentie en intensiteit resolutie beperkt de kwaliteit van het gehoor met CI. Hier beschrijven we optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw in muizen als een alternatieve strategie voor auditieve research en ontwikkeling van toekomstige CI's.

Abstract

Directe elektrische stimulatie van de spiraal ganglion neuronen (Sgns) door cochleair implantaat (CI) kan geopend spraakverstaan ​​in het merendeel van de geïmplanteerde dove proefpersonen 1-6. Niettemin geluidsverwerkingsalgoritme met huidige CI heeft slechte frequentie en intensiteit resolutie door brede stroomspreiding van elk contact elektrode activeren een groot aantal Sgns langs de tonotopische as van het slakkenhuis 7-9. Optische stimulatie wordt voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie die ruimtelijk meer belooft beperkt activatie van Sgns en derhalve hogere frequentieresolutie codering. De laatste jaren heeft directe infrarood verlichting van de cochlea gebruikt om reacties oproepen bij de gehoorzenuw 10. Toch vereist het hogere energieën dan elektrische stimulatie 10,11 en de onzekerheid blijft bestaan ​​over het onderliggende mechanisme 12. Hier wordt een methode op basis van optogenetics om Sgns stimuleren beschrijven wemet een lage intensiteit blauw licht, met behulp van transgene muizen met neuronale expressie van channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 of-virus gemedieerde expressie van de ChR2-variant Catch 14. We gebruikten micro-light emitting diodes (μLEDs) en vezel gekoppeld lasers om ChR2 expressie Sgns stimuleren door middel van een kleine kunstmatige opening (cochleostomie) of het ronde venster. We getest de reacties van hoofdhuid opnames van licht-evoked potentials (optogenetische auditieve hersenstam respons: oABR) of door micro-elektrode opnames van de auditieve route en vergeleken hen met akoestische en elektrische stimulatie.

Introduction

Volgens de World Health Organization, 360 miljoen mensen wereldwijd lijden aan gehoorverlies. In dove proefpersonen, directe elektrische stimulatie van Sgns door CIS staat geopend spraakverstaan ​​in de meerderheid van hen 1,2,4,5. Ook al CI geïmplanteerd bij meer dan 200.000 mensen, dus de meest succesvolle neuroprothese, geluid codering gedreven door de huidige cochleaire implantaten is beperkt. CI's door elektrische stimulatie een aantal elektrodes waar iedereen activeert een tonotopische gebied van de gehoorzenuw aldus de disfunctionele sensorische orgaan van Corti omzeilen in de cochlea. Normaal horende luisteraars kunnen discrimineren meer dan 2000 frequenties, maar de huidige CI's gebruiken slechts tot 12-22 frequentie kanalen 4. Dit komt door wijdverspreide stroom uit elke prikkelelektrode 7,9 activering van een groot aantal Sgns dat vele verschillende geluidsfrequenties 8,15 vertegenwoordigen. Dezebeperking kan worden verbeterd met behulp van multipolaire stimulatie, maar ten koste van hogere stroomverbruik 16,17. Hun output dynamisch bereik voor geluid intensiteit is ook beperkt, meestal onder de 6-20 dB 4,18. Om deze redenen, het verbeteren van de frequentie en intensiteit resolutie zijn belangrijke doelstellingen voor het verhogen van CI prestaties om spraakherkenning te verbeteren in rumoerige omgevingen, prosodie begrip en muziekbeleving.

Een andere optie om de gehoorzenuw stimuleren is optische stimulatie. Licht kan gemakkelijk worden gericht op een kleine populatie SGN target veelbelovende betere ruimtelijke opsluiting toenemende frequentie resolutie en ook groter dynamisch bereik, wat resulteert in een betere resolutie intensiteit. Inderdaad, cochleaire stimulering met infrarood licht heeft uitstekende frequentieresolutie in diermodellen 10,11,19. Een nadeel van dergelijke stimulatie is dat het hogere energieën dan elektrische stimulatie vereist <sup> 10,11. Bovendien zijn zorgen over het vermogen van de methode om direct te stimuleren auditieve neuronen geuit 12,20.

Als alternatief voor infrarode stimulatie, in dienst nemen we optogenetics te renderen Sgns licht gevoelig. Optogenetics is een nieuwe benadering die genetische en optische technieken combineert non-invasively en specifiek controle cellen met hoge temporele precisie (reviews 21 en 23). De momenteel meest gebruikte modaliteit stelt de expressie van microbiële channelrhodopsin 2 (ChR2) gen van Chlamydomonas reinhardtii en varianten daarvan, coderend voor een lichte-gated kation kanaal 24. ChR2 is een 7-transmembraan-helix eiwit dat bij getransduceerd tot neuronen en geactiveerd door blauw licht, fungeert als niet-selectief kation-kanaal, waardoor depolariseren de cellen 24-27. ChR2 is goed gekarakteriseerd 24,28- 31 en veel varianten ontwikkeld om actio wijzigenn spectrum, poorten en permeabiliteitseigenschappen 32,33. Het doel van ons werk is cochleair optogenetics stellen voor de activering van de gehoorbaan. We merken dat de optogenetic benadering van de gehoorzenuw stimuleren vereist genetische manipulatie van de ganglion spirale voor de expressie van channelrhodopsin. Werken met muizen en ratten maakt het gebruik van beschikbare transgene dieren 13,34,35, die expressie van channelrhodopsin bieden weinig variabiliteit langs de tonotopische as en in dieren 36. De combinatie van voorwaardelijke allelen 37 met de juiste Cre-lijnen zorgt voor cel-specifieke expressie. Genoverdracht in de ganglion spirale andere dieren het gebruik van virussen zoals adeno-geassocieerd virus dat een standaard aanpak optogenetics 38 en dat we bleek goed in muizen 36. Genetische manipulatie en expressie van transgenen coderend buitenaardse eiwitten beer risico op bijwerkingen zoals immune reacties en / of proliferatie, gecompromitteerde toestand of zelfs de dood van de genetisch gemanipuleerde cellen. Ten behoeve van deze demonstratie gebruiken we transgene muizen die ChR2 in ganglion spirale neuronen onder Thy-1 promotor 13 optisch stimuleren gehoorbaan. We merken dat andere channelrhodopsin varianten kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel als we aangetoond met virus-bemiddelde overdracht van de variant val 14 in Sgns 39.

Terwijl cochleair optogenetics vereist genetische manipulatie, het biedt moleculaire afstelling voor optimale SGN stimulatie en beloften verbeterde frequentie en intensiteit resolutie in vergelijking met elektrische stimulatie. Optogenetische stimulatie van de auditieve route is zeer relevant voor het horen van het onderzoek. Zo belooft vooruitgang in studies van de activiteit-afhankelijke verfijning van tonotopy tijdens de ontwikkeling, in de analyse van de vereiste spectrale integratie geluid localization en de mate van interactie tussen frequentiespecifieke afferente projecties in het centrale auditieve systeem.

Protocol

Alle experimenten die in dit werk werden uitgevoerd met de ethische normen gedefinieerd door de Duitse wet betreffende de bescherming van proefdieren. De universiteit van Göttingen raad voor dierenwelzijn en het welzijn van dieren kantoor van de deelstaat Nedersaksen ingestemd met de experimenten. 1 Voorbereiding van μLED-stimulator Voor μLEDs, eerst de μLED-stimulator te bereiden. Gebruik blauwe LED's met 200 van 200 micrometer actieve oppervlak (μLED, zie Materialen tab…

Representative Results

Een optimale cochleostomie kritisch en verhoogt de kans op een succesvolle experiment. Hierdoor Venster regelmatig is klein, en er is geen schade van de interne cochleaire structuren. Bijvoorbeeld, bloeden geeft beschadiging van de stria vascularis. Een goed voorbeeld is weergegeven in figuur 1B. Met behulp ChR2-transgene muizen, wordt ChR2 uitgedrukt in de Sgns binnen het slakkenhuis (figuur 1C). Blauw licht verlichting, hetzij door ?…

Discussion

De beschreven experimenten tonen het optogenetic stimulatie van de Sgns en kan in principe ook worden gebruikt om binnenste en / of buitenste haarcellen te stimuleren, mits de expressie van opsins. Deze experimenten vereisen veel geduld en zorg. Zoals eerder vermeld, de meest kritische stappen is een goede cochleostomie / ronde venster insertie en een geschikte positie en oriëntatie van de lichtbron.

Er zijn beperkingen met optogenetische stimulatie bij gebruik ChR2. In ons geval oABR ampli…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Bernstein Focus voor Neurotechnology verlenen 01GQ0810, aan T. Moser, en MED-EL Duitsland); de Duitse Stichting voor Onderzoek door het Center for Nanoscale Microscopie en Moleculaire Fysiologie van de hersenen (FZT 103, T. Moser) en via de SFB889, N. Strenzke en T. Moser).

Materials

Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 – Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473-nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

Referenzen

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

View Video