מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה
Summary
דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.
Abstract
דג הזברה הפכה אורגניזם מודל בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ביולוגיה התפתחותית ולמחקר של מחל מחלות של בני אדם בשל המידה הניכרת של שימור גנטי בבני אדם. גנטיקה כימית כרוכה בבדיקת ההשפעה שיש לי מולקולות קטנות בתהליך ביולוגי והופכת לשיטת מחקר translational פופולרית לזהות תרכובות טיפוליות. דג הזברה פונה באופן ספציפי לשימוש עבור גנטיקה כימית בגלל היכולת שלהם לייצר אחיזה גדולה של עוברים שקופים, שמופרים באופן חיצוני. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים להיות בקלות בסמים מטופלים על ידי התוספת הפשוטה של מתחם לתקשורת העובר. שימוש בכל הר הכלאה באתר (רוצה), ביטוי mRNA ניתן בבירור דמיין בתוך עוברי דג הזברה. יחד, בעזרת גנטיקה כימית ומאחלים, דג הזברה הופכת הקשר האורגניזם שלם חזק בו כדי לקבוע את סלולארי ופיזיולוגיהשפעות של מולקולות קטנות. התקדמות חדשנית נעשתה בטכנולוגיות שעושות שימוש בהליכי מיון המבוסס על מכונה, אך למעבדות רבות אפשרויות כגון אינן נגישות או להישאר עלות אוסרני. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע מסך מדריך לתפוקה גבוהה כימי גנטי שדורש משאבים בסיסיים ויכולים להתבצע על ידי צוות בודד או קטן אחת בתקופה יעילה של זמן. כך, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה אפשרית שיכול להיות מיושמת על ידי קבוצות מחקר לבצע גנטיקה כימית בדג זברה, אשר יכולה להיות שימושית להשגת תובנות יסוד לתהליכים התפתחותיים, מנגנוני מחלה, ולזהות תרכובות חדשות ומסלולי איתות שיש לי יישומים רלוונטיים מבחינה רפואית .
Introduction
זיהוי של סמי מרפא יעילים לטיפול במחלה אנושית הוא סוף המשחק להרבה חוקרים ביו-רפואיים. בעוד זיהוי והאפיון של סוכנים תרופתיים פוטנציאל ליישומים קליניים יש ערך ברור לבריאות, היא נותרה אתגר משמעותי. סופו של דבר, את הפיתוח של תרכובות רבות טיפוליות מגיע מהידע של איך סוגי תאים מסוימים או לפתח או פונקציה. דג הזברה, Danio rerio, היא חוליות מים מתוקים של משפחת Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל הזרם המרכזי בביולוגיה התפתחותית 1. דג הזברה הן גנטי חוליות צייתניות כי הם קל לשמור ולטפל במחקרים מדעיים 2,3. עוברים דג הזברה הוא שקוף, מופרה חיצוני, ויכול להיות מיוצר על ידי מאות מזוג הזדווגות מבוגר יחיד בשבוע 2,3 בלבד. יתר על כן, מערכות דג הזברה מניות עיקריות באיברים ויש ד גדולegree של דמיון גנטי ליונקים, כולל בני אדם 4. באופן מפתיע, 70% מהגנים באדם יש orthologue דג הזברה 4. בשל דמיון זה, דג הזברה הייתה מערכת ניסיונית רלוונטית ביותר לחקר המנגנונים של התפתחות חוליות ופיזיולוגיה, והיית מועסק לשחזר מספר רב של מחלות בבני אדם 5-7. מסיבות אלה, בין השאר, הפכו את המועמד אידיאלי דג הזברה להמשך חקירות גנטיות והביאה לייסוף במגמת עלייה מתמדת לשירות של דג הזברה במחקר ביו-רפואי 6,7.
במהלך העשורים האחרונים, שפע של כלים גנטיים פותחו בדג הזברה. הגנום דג הזברה ניתן לmutagenesis וtransgenesis 3. עד כה, שפע של קדימה לאחור מחקרים גנטיים בוצעו, הוביל לדור של מעל 9,000 מוטציות 3. יתר על כן, קווים מהונדסים רבים יש להיותen יצר, אשר איפשר התיוג ובידוד של סוגי תאים מסוימים 3. היו מאמצים מתמשכים משמעותיים לרכז ולחלק את המשאבים הללו לקהילת המחקר, אשר נגישים למעבדות בעלות נמוכה למדי באמצעות מרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (Zirc) 8. יתר על כן, מאגר נרחב של מידע ביולוגי וכלים מולקולריים, הנעים בין דפוסי ביטוי גנים לMorpholino רצפים ופרוטוקולים, כבר מבואר בהדרגה ברשת הזברה המידע (ZFIN) 9-11. תשתיות מחקר דג הזברה אלה מתאפשרות באמצעות תמיכת NIH משמעותית וסנגור של מודל זה חי 8. מטמון זה של מוטנטים דג הזברה, קווים מהונדסים, ומידע רלוונטי ממשיך להיות של ערך יוצא דופן לקהילת המחקר הביולוגית בכללותו. עם זאת, בזמן שדג זברה היא עכשיו אורגניזם מודל מבוסס היטב ומראש יחסנים, הם מייצגים להrgely מאגר שלא נוצל ללמוד ביולוגיה ומחלות התפתחותיות באמצעות השימוש במסכים גנטיים כימיים.
גנטיקה כימית היא השימוש במולקולות קטנות, כגון תרופות או חומרים אחרים, כדי להשפיע על תהליך ביולוגי בתוך מערכת חיים 12. יכולה להיות מיושמת גנטיקה כימית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד גן, כגון לזהות סוכני הצלה שאו להחמיר פגם גנטי ספציפי 12. יתר על כן, גנטיקה כימית מייצגת שדרת אחת גדולה בכדי לבצע מחקר translational 12. בעוד מסכי גנטיים קדימה מסורתיים במודלים של בעלי חיים היו מאוד חזקים בקישור גנים ספציפיים למחלות, שאין להם ממד זמן, ולכן קשה או לפעמים אי אפשר לצפות פנוטיפים שיקומו לאחר עובר מוקדם. בנוסף, יתירות גן יכולה להפוך את התוצאות שנצפו מגנטיקה קדימה קשה לפרש. לחלופין, מסכי גנטיים כימייםלאפשר לשליטה זמנית בסדר ובו זמנית מספק נקודת התחלה רבת ערך לגילוי סמים 12,13.
ניתן לבצע גנטיקה כימית באמצעות במערכות חוץ גופית (לדוגמא, שורות תאים, חלבונים) או באמצעות מערכת in vivo, כגון האורגניזם כולו. שימוש במערכת במבחנה לגנטיקה כימית יכולה להיות מועילה, כי זה פשוט יותר מאשר מערכת האורגניזם שלמה, קל יותר לעבוד עם בקנה מידה גדול, פחות יקר, ופחות זמן רב. כתוצאה מכך, במבחנה מערכות מאפשרות לשניהם תפוקה גבוהה הקרנה (HTS) וגבוהה הקרנת תוכן (HCS). יש מספר היתרונות לשימוש במערכת במבחנה שיש לשקול בעת התקרבות גנטיקה כימית, אלא גם מגבלות משמעותיות. מגבלה עיקרית אחת לשימוש בשורת תאים היא שמולקולות קטנות יכולות להיות יעילות ולא רעילים בשורת תאים ספציפית, עדיין להיות רעיל כאשר הציגו את האורגניזם כולו. כך, עיקרמהעניין הוא שבמבחנת מערכות אינן ממצות את ההקשר הרחב של האורגניזם ובשל כך אינן תמיד מסוגל לחקות במדויק את מה שקורה באורגניזם שלם. בעוד בדיקת מתחם בכל האורגניזמים יכולה לעקוף בעיות אלה, השימוש במודלי האורגניזם שלמים יונקים מציב מספר המגבלות פיזיות ומוסריות. לדוגמא, הקרנת סמים בעכבר מתעכבת מבחינה לוגיסטית על ידי המרחב וההוצאות הדרושים כדי לבדוק גודל מדגם הולם. בנוסף, שאלות התפתחותיות יכולות להיות קשות ללמוד, בשל העובדה שהיונקים להתפתח ברחם. לבסוף, בעוד שההתנהלות של מחקר הביו-רפואי יש ערך חברתי עצום, יש בכל זאת צרכי משמעותיים כדי להגן על רווחת בעלי חיים על ידי הגבלת לימודים אינטנסיביים והקלת הכאב וסבל של בעלי חיים המשמשים למחקר. דג הזברה תהווה תחליף בר-קיימא לעבודה עם חוליות גבוהות כמו יונקים, ויתר על כן, ניתן ללמוד נושאים רבים באמצעות גנטיקה כימית בהשלבים העובריים וזחל כאשר עיבוד נוירולוגיות נעדר או אופרטיבי ברמה נמוכה 12,13.
עד כה, מספר עצום של מסכי גנטיים כימיים בוצעו שימוש בעוברי דג הזברה בפרט, כמסירת מתחם יכולה להיות מושלמת על ידי שיקוע של עוברים בתקשורת המכילים את התרופה של העניין 12-15. יתר על כן, הייתה התקדמות מדעית וטכנולוגית רבות כדי להפוך את המסך גנטי כימי אפשרי והניהול 16-20. פיטרסון ועמיתיו היו הראשון שהשתמש בדג זברה במסך גנטי כימי בשנת 2000, ומאוחר יותר בשנת 2004 זוהה תרכובת שדוכאה מוטציה קוארקטציה של אב העורקים ב21,22 דג הזברה. מסכי כימיים מאז יושמו ללמוד כמה רקמות מתפתחות (לדוגמא, לב, דם, כלי) 23-25, פונקציות פיסיולוגיות (למשל, בסיס הנוירולוגי להתנהגות) 26, התחדשות מבוגרת 27,28, וdiseas מודלים דואר (לדוגמא, מחלת ניוון שרירים וסרטן) 29,30. מבין המסכים כימי דג הזברה אלה, הגילוי שפרוסטגלנדינים להסדיר בתאי גזע hematopoietic נלקח לניסויים קליניים בבני אדם, הממחיש את הכח לעבור מ" טנק למיטה "23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). לאחרונה, תרופות מועמד מבטיחים צמחו לאיברים מורכבים כמו הכליות, שתקנו פתולוגיה הסלולרית במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34 וניזק כלייתי חריף 27,35, אם כי אלה עדיין לא לעבור לניסויים קליניים. מסכי גנטיים הכימיים אלה באופן רחב להדגים את התועלת של בדיקת תרכובות קטנות של דג הזברה פיתוח והיכולת ליישם את גנטיקה כימית לחקור תפקוד רקמות בוגר. יתר על כן, יש רשימה הולכת וגדלה של אוספי פרמקולוגיה זמינים מסחרי הניתנים ללימודים אקדמיים 19.
ove_content "> בשנים האחרונות, חל התקדמות בולטת בטכנולוגית סינון גנטית כימית, כוללים השימוש במערכות אוטומטיות של רובוטים מחלק סמים וטיפול, יחד עם מערכות הדמיה אוטומטיות 36-38. מערכות כאלה מאפשרות לאפשרות של בדיקת אלפים רבים של תרכובות להשיג שני HTS וHCS 36-38. למרבה הצער, ההתחייבות של מסכי גנטיים כימיים עם ארגונים רובוטית החדשניים אלה בדרך כלל דורשות משאבים רבים. משאבים אלו סוגי מכשול משמעותי למוסדות רבים שאין להן ההון כדי לרכוש , תתפעל, תתחזק ומכשור כזה. בזמן הקמת התשתית לטיפול רובוטית של ספריות כימיות, ובכלל זה העברת עוברים לערוכות צלחות, נשאר עלותו למעבדות רבות, הדמיה ממוחשבת, ובניתוח היא בדרך כלל נגישה יותר 12. הקרנת תמונה אוטומטית מאפשרת כימות מחדש מהונדס ניאוןסבלים ומאפשרים ניתוח פנוטיפי הספציפי 12,15.למרות שמערכות אוטומטיות מייצגות התקדמות טכנולוגית שימושית, ניתן לטפל שאלות רבות על ידי מסכי מדריך לממוקדים יותר, כגון השאילתה של כמה אלף תרכובות פעילות ביולוגית על תהליך התפתחותי עם כל הר הכלאה באתר קריאה (רוצה) 39. יתר על כן, בעוד שמספר הולך וגדל של מעבדות לגייס לעזרתם מסכי כימי דג הזברה לחקור שאלת מחקר, כמה הרוויה ונושאים רבים (אם בכלל) מאמצים הגיעו טרם נפרצו בעזרת גנטיקה כימית. ניתן לבצע מסכי כימיים באמצעות מושבה דג הזברה קטנה המכילה רק כמה סוג בר או טנקים מהונדסים. לכן, זה סוג של חקירה גנטית צריך להיות בר-השגה על ידי רוב קבוצות מחקר דג הזברה מעוניינת להרחיב / גיוון לזירה זו. ספריות כימיות בגדלים שונים יכולות להיות רכש ממפיץ ו / או col מסחרייםlaborators. מסיבות אלה, גנטיקה כימית יכולה להיות כדאי מבחינה כלכלית גם באקלים מימון קשה. עם זאת, ישנם מכשולים למתחילים מסך גנטיקה כימית, כגון איך לתכנן היבטים לוגיסטיים של המסך: למשל, באופן ידני דגימות תהליך של מצבת כוח האדם הדרוש למסך מוצלח, הקצאת הזמן הייעודי ולצרף יחד פרוטוקול פיזי מספר שממאה לכמה אלף. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעובר דג הזברה עם רצון כמו קריאה מתוך. שיטה זו כרוכה טיפול תרופתי של עוברי דג הזברה, ואחריו זיהוי riboprobe של תעתיקי mRNA. שימוש בפרוטוקול זה, צוות קטן או אפילו אדם אחד יכול להקרין באופן סביר ולנתח ספרייה כימית צנועה כ -600 תרכובות בפרק הזמן של 9 שבועות.
Protocol
Representative Results
Discussion
גנטיקה כימית בדג הזברה יכולה לעשות השפעה קריטית על ההתקדמות של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מספק שיטת תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם רצון לקריאה החוצה, בצורה יעילה ומאפשר צוות בודד או קטן לנהל מסך מולקולה קטן. שיטה המינימלית של משאביי-זה מרחיבה את הכדאיות של גנטיקה כימית לקבוצות מחקר רבות. באופן ספציפי, אסטרטגית מסך זה מספקת אלטרנטיבה חשובה לשימוש במכשור רובוטי, כמו מערכות כאלה הן לא רחבה נגישות בכל מחלקות מחקר. מסך במדריך זה מאפשר לו אדם אחד כדי לבדוק את הצלחת גם אחד 96 של תרכובות עם קריאה רוצה בשבוע עבודה בן 6 ימים. מאז דג הזברה הם מֵטִיל בֵּיצִים, עם העוברים מתפתחים מחוץ להורה, ואת העוברים הם גדולים מספיק כדי לראות בעין בלתי מזוינת (בין 1-3 מ"מ), הם נוחים לטיפול ידני במכשירים פשוטים והחוקר יכול דגימות מערך בצלחות רבות גם ללא שימוש במיקרוסקופ. יתר על כן, מאז דג הזברה מתפתחת במהירות, חשיפת מולקולה קטנה יכולה להיות יעילה בטיפול יחיד של מתחם, ולא במינונים חוזרים ונשנים, אשר ממזער עיבוד ידני נוסף. עוברי דג הזברה בקלות מתורבתים כי החלמון שלהם מספק מקור תזונה עד 5-6 ימים לאחר הפריה, אשר מבטלת את הסיבוך של דגיגי האכלה. בנוסף, הרוב המכריע של איברי הזחל פיתח והפך פונקציונלי בתקופה זו, המספקת ההזדמנות ללמוד מגוון רחב של שאלות מחקר. בנוסף הפשוט של מולקולות קטנות לתקשורת הדגירה העובר אינו פולשני ומאפשר לחוקר (ים) כדי לבחור למנת תרופה, זמן של בנוסף, ומשך זמן של מתן שליטה הדוקה על משתנים רבים ומאפשרת לתהליכים התפתחותיים ספציפיים ובכך-חשיפה של ריבית ששאל. כפי שתואר כאן, הפרודוקטיביות מחקר משמעותית יכולה להיות מושגת בtimefr קצרהame שימוש במתודולוגיה מסך במדריך זה. מניסיוננו, יש תשואה גבוהה על המאמץ שהושקע, שיכול להיות מודגשת על ידי שימוש בספרייה כימית ביו ידוע לנתח תהליך של עניין, כגון פילוח נפרון במהלך פיתוח כליות (איור 4; Poureetezadi וWingert, לא פורסם).
המסך כימי הוראות שמתואר כאן הוא תכליתי במיוחד משום שהיא כוללת assay על דגימות דג הזברה קבועות. לדוגמא, אסטרטגיה זו יכולה להיות מתוקנת כדי לבדוק כמה צלחות של תרכובות בשבוע אחד ולאחר מכן להבקיע עוברים בשבוע הבא. מבחני חלופיים על דגימות דג הזברה קבועות, כגון הכנות אימונוהיסטוכימיה או צביעת רקמות אחרת, יכולים גם להיות תחליף לרצון קריאה החוצה. אסטרטגיות ניסיוניות לביצוע מבחני סלולריים בדג הזברה הם ישימים בשל הבהירות והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות מוקדמים. יתר על כן, חוקרים יכולים לעכב פיגמנטציה בSTA מאוחר יותרGES שימוש בכימיקלים או להימנע מהסיבוך של פיתוח פיגמנט לגמרי באמצעות השימוש בקווים גנטיים פיגמנט-פחות כמו קספר או דג הזברה מוחלט 13. זה אפשרי לנהל באופן ידני מולקולות קטנות, לעבד את הכתם (ים) של עניין, ולהבקיע באופן ידני עובר באמצעות סטראו פשוט. עם זאת, חשוב לזכור כי ניתוח תמונה אוטומטי יכול להתבצע, ועשוי למעשה להיות נדרשים לניתוח פנוטיפ ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זה יכול להיות עדיף על מערכת ניתוח תמונה אוטומטית עם assay ישיר, שותף כגון כתב מהונדס, כמו זה מייעל את העיבוד הידני של דגימות, מכמת הבדלים לא בקלות ניתן להבחין בעין בלתי מזוינת, ומבטל הטיה חוקר 15. למרבה המזל, כמה מערכות הדמיה אוטומטיות שניהם ידידותי למשתמש וחסכוני במונחים של עלויות תוכנת 15. השימוש והיכולות של מערכות אוטומטיות אחרות במהירות התפתחו ויכוליםלהיות בשימוש לאורגניזמים אוריינט, לנהל טיפולים תרופתיים, ואפילו להעתיק את מקום מגורי אורגניזמים 12,15. מערכות אוטומטיות אלה בישרו עידן טכנולוגי חדש של מחקר וספקו פתרונות חדשניים כדי לתפעל כמויות גדולות של נבדקים ובכך לבצע HTS וHCS גישות באורגניזמים שלמים 12,15. בעוד מכונות כאלה הן ללא ספק כלים שימושיים, הם גם מאוד יקרים ונמצאים מחוץ להישג ידם של רבים מעבדות מחקר בסיסיות. ללא גישה ליכולות האוטומטיות אלה זה אולי נראה כי מסכי כימיים אינם אפשריים. עם זאת, פרוטוקול זה מתאר מדריך לכיצד לנהל מסך במדריך, שניתן להשתמש כדי להשלים את מסך גנטיקה כימית באופן מעשי על פרק זמן סביר.
חסרונות לשתי הגנטיקה הקרנה וכימית המדריך באופן כללי קיימים, וצריכים להישמר בחשבון כאשר שוקלים מסך כימי. בפרט, השיטה הפגינה כאן מחייבת מידה מתונהשל מיומנות פיזית. חשש זה הוא מצומצם או בטל לגמרי דרך חזרה, כמו מיומנות תשפר עם תרגול. בנוסף, יש מקום מינימאלי לשגיאה גסה, שכן יש רק 10 עובר לכל גם לניתוח. מולקולות קטנות יכולות להשתנות בחדירות של פנוטיפ שנגרם, כך משטר ניקוד סביר לזהות תרכובות של עניין יש לדבוק. זה חיוני כי חוקרי ניצול פרוטוקול זה להמציא קריטריונים קפדניים כראוי למה שהם ישקלו להיט. כמו כן, חשוב לזכור שהטבע של צורה זו של מסך יהיה ככל הנראה להניב חלק מסוים של תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיות שמסומן באמצעות עבודה-עד כימית נוספת. יתר על כן, זה קריטי לשלב עוברים מדויקים ולאסוף מצמדים להקרנה זמן קצר לאחר הפריה, כמו פיתוח אסינכרוני יכול להוביל לסיבוכים באופן מדויק להעריך את ההשפעה של טיפולים תרופתיים. יתר על כן, בכל הקשור להקרנה כימית לשעבראסטרטגית perimental, יש שורה של מגבלות. מסיסות ורעילות של מולקולות נושאת מתחם (לדוגמא, sulfoxide דימתיל (DMSO)) יכולים גם להציג נושא ויכולים להיות מונע בבדיקת מולקולות רבות. סיסית יכול לשמש גם מחסום לחשיפה לסמים. לבסוף, למרות שדג זברה היא מודל רב עוצמה וtranslational לגנטיקה כימית, טיפול צריך תמיד לקחת בקביעה האם אסטרטגית מסך כימית חלופית, למשל, שימוש במערכת במבחנה כגון שורת תאים, ניתן להחליף לשימוש בכל בעלי חיים. עם זאת, טיפול כימי במערכת דג הזברה השלמה נחשב עדיף על ניהול גישות דומות ביונקים, כפי שהיא מספקת את היתרון של איסוף ההשפעות המערכתיות של התרכובות ויכולה לאפשר לחוקרים למיין את רשימת התרכובות להיבדק במודל של יונקים.
עד כה, מסכי כימיים דג הזברה סיפקו לא כלי ניסיוני חזקo להתוות המנגנונים של פיתוח ולוודא סוכנים תרופתיים מועמד לשימוש ברפואה, כגון זיהוי של מולקולות מסוגלת למנוע פתולוגיות מחלה. לדוגמא, מחקר על ידי ברנס ועמיתיו פיתח assay מיקרו-ואוטומטי לקצב לב לשימוש בעוברי דג הזברה מהונדסים שהביעו GFP בשריר הלב 42. הם השתמשו בקו מהונדס זה כדי לנתח את קצב לב בפיתוח וכיצד הוא הושפע על טיפול תרופתי 42. מחקר אחר, על ידי בדיקת צפיפות האוכלוסייה של תאי גזע hematopoietic בעובר דג הזברה, זיהה שE2 פרוסטגלנדין מסדיר את הנישה HSC 23. ממצא זה קבל תוקף בעכבר, ולאחר מכן בוצע לבדיקה קלינית בהשתלות טבורי אנושיות 23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). באמצעות מספר מחקרים שנעשה לאחרונה, גנטיקה כימית הוכיחה להיות שימושי בלימוד מחלת כליות באמצעות דג הזברה <sעד> 43. כליות דג הזברה מספקת פרדיגמה מצוינת ללמוד nephrogenesis או התחדשות של נפרון, היחידה התפקודית המרכיבות את הכליות במהלך פציעת פיתוח וכליות חריפות 43. מבנה נפרון הוא שמור ביותר בין הכליה עוברית דג הזברה והמבוגרת בכליות יונקים 44-50. מספר מחקרים שבחנו את הכליה העוברית דג הזברה להדגים בבירור את פוטנציאל translational הטבוע בו כאשר יחד עם גנטיקה כימית. מסך גנטיקה כימית בוצע בשני מוטנטים דג הזברה שמופו לpkd2 גנים וift172, אשר ידוע להיות שחקני מפתח במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34. המסך הביא זיהוי deacetylase פאן-היסטון (HDAC) מעכב trichostatin (TSA) כמולקולה קטנה שיכול לבטל את הפגמים מורפולוגיים נראים בדרך כלל בעוברי המוטציה. גישה שונה ננקטה על ידי דה Groh ועמיתים הוקרנה תרכובות הinducבצקת ed בעוברי דג הזברה wild-type, דבר המצביעים הפרעה בתפקוד כליות 35. לאחר זיהוי PTBA כלהיט, הם הבחינו כי בנוסף לגרימת בצקת, PTBA גם הגדיל את הביטוי של pax2a, סמן לאבות כליות. חשוב לציין, נגזר ממוטב של PTBA אז הראה ירידת התמותה אחוזים של דג הזברה מבוגרת שעברה נזק לכליות הנגרם גנטמיצין ויתר על כן, האיץ את ההתאוששות של עכברים שסבלו מנזק כלייתי 27. יחדיו, תרומות אלה מגנטיקה כימית דג הזברה להציג הסוגים של תגליות שיכולים להתבצע תוך שימוש בשיטה שתוארה בפרוטוקול זה.
למרות שמחקרי גנטיקה כימית נושאים הכשרון ניכר, זה לא בלי אתגרים מסוימים. אך ורק תוך שימוש בגישה גנטיקה כימית יכול לעשות את זה מסובך כדי לקבוע את הגן הספציפי או גנים המושפעים מתחם. גם אם יעד (ים) נמצא, siפער gnificant יכול להישאר בין הזדהות מתחם והבנת המנגנון (ים) של פעולה שבה המולקולה הקטנה מתנהגת. לדוגמא, זה יכול להיות קשה לקבוע את המנגנון שבו מולקולה קטנה פועלת כי מתחם אחד מסוגל לנהל מגוון של אפקטים שונים בתוך האורגניזם. עם זאת, עם כניסתו של טכנולוגיה חדשה והמסכים גנטיים כימיים יותר הושלמה בדג זברה, הבעיה של קביעת מנגנון מתכווצת. שיטה אחת כדי לקבוע את ההשפעות מולקולריות של תרכובות שזוהו היא לבחור ספריית תרופות של bioactives הידוע להקרנה, שבו מנגנונים ניתן להסיק שעלולה להיות מהנתונים מבואר בעבר. בנוסף, אלגוריתמי chemoinformatic, כמו שער גילוי, זמינים לשימוש שיכול להשוות דמיון מבני של מתחם מול מסד נתונים של תרכובות עם מנגנונים מיוחסים 14. דרך נוספת על מנת להבהיר את המנגנון של מתחם תהיה ליצור MICRoarray פרופיל לאחר טיפול ולאחר מכן לבצע שאילתא פרופיל זה באוסף של פרופילי תרופת microarray, כגון קישוריות מפה, מחפשת תרכובות מוגדרות באופן מכניסטי שתעוררנה אפקט דומה 14. גם גישה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות גנטיות שיש לו השפעה דומה לזו של תרכובת של עניין. מציאת קשר בין מתחם ומוטציה יכולה להציע שהמתחם פועל במעלה הזרם או במורד הזרם מולקולריים של הגן קשור, אשר יכול להיות שמסומן על ידי טיפול במוטציות עם המתחם וmorpholinos. אפשרות נוספת תהיה ספקטרומטריה, שממשיכה להיות אופטימלי יותר לדג זברה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להתוות שינויים ספציפיים חלבון או שלאחר translational שינויים לאחר טיפול תרופתי. לבסוף, מולקולות קטנות או אפילו ספריות שלמות הן לפעמים מסוגלים להיות מתויג לנפתח של שותפים המחייבים. זה גם ראוי לציין, כי בעוד שהמנגנון של איך פונקציות מולקולה קטנות אנישל יבוא משמעותי, יש תרופות שאושרו ע"י ה- FDA שלמנגנונים אינם ידועים.
למרות שדג זברה תערוכת קווי דמיון רב ליונקים שני גנטית ופיסיולוגי, יש עדיין בעיה של מוצלב התרופה 14. מחקר בדק את היכולת המוצלב של הלהיטים ממסך למעכבי מחזור התא בעוברי דג הזברה 50. המסך גרם לזיהויו של 14 להיטים שלא היו ידועים קודם לכן לבעלי פעילות מחזור התא. מתוך 14 תרכובות אלו, 6 נמצאו כבעלי פעילות מחזור תא בשני מבחני תרבית תאים אנושיים ודג זברה, 3 הוצגו להיות סרום מומת במבחני תרבית תאים, 1 היה פעיל רק בתאי דג הזברה, ו- 4 לא היו פעילות בכל אחד מ דג הזברה או מבחני תרבית תאי אדם, אבל רק בכל אורגניזם דג הזברה. יש לציין, 4 תרכובות שרק פעילות בדג הזברה מראות כי יש הבדלים בין דג הזברה ויונקים שעשויים prohiנשך את פוטנציאל translational של תרכובות מסוימות. זהו שיקול חשוב להיות מודע ל, עם זאת יש דוגמאות של מולקולות קטנות, כמו PGE 2 שמגביר את היכולת של HSCs לנקלט במקבלים אנושיים וPTBA נגזרים המשפרים את קצב התאוששות כליות אצל יונקים, ובכך לספק ההוכחה עיקרון מוצלב שאפשר 23,31-33.
ללא קשר למלכודות הללו, גנטיקה כימית וגישה מינימאלי-משאב זה יש הרבה מה להציע לקהילת המחקר. גנטיקה כימית שימושית במיוחד בדג הזברה ותמשיך לשחק תפקיד קריטי בחקירת מסלול מולקולרית וגילוי סמים. מסכי כימיים המבוססים על מטרות מולקולריות בדידות שהיו בשיעור כישלון גבוה מבחינה היסטורית בשל מה שמכונה קבוצת הכוכבים של ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ומאפיינים טוקסיקולוגית (ADMET) 51. מסכי כימיים ניצול דג הזברה ללהתמקד בתהליך, ולא יעד דיסקרטי, יכול לעקוף כמה בעיות ADMET ולזהות תרכובות שנמצאות יעילים בהקשר של האורגניזם כולו. עם הבריכה הולכת וגדל של משאבים זמינים למחקר דג הזברה, כוללים זנים מוטנטים הנוכחיים ואת היכולת להשתמש בעריכת הגנום ליצור מוטציות גנטיות ממוקדות וtransgenics, יש כמעט מספר בלתי מוגבל של מסכים גנטי כימי פוטנציאלי באמצעות דג הזברה. ספריות כימיות רבות כבר אצרו, ואוספי תוחלת עם bioactives הידוע, תרכובות רומן, מבחינה מבנית מגוונות ומבני דומות. ריאגנטים אלה מספקים שפע של הזדמנויות עבור שילובי מסך שכרגע זמינים וצפויים לגדול עוד יותר בשנים הקרובות. עם אפשרויות אלה ביד, פרוטוקול ידני ותפוקה גבוהה זה מספק דרך מעשית וידידותי למשתמש כדי להגדיל את היכולת של קבוצות מחקר לבצע מסכי גנטיים כימיים באמצעות דג הזברה.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון למעבדת מחקר Wingert מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרץ # ענק הפרס 5-FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים פול ט 'Kroeger, ג' וניור למתן משוב ביקורתי על כתב היד. אנו מודים לצוות מהמחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטר דאם על מסירותם היוצאת מן הכלל בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברי researהמעבדה ch להערות, הדיונים שלהם ותובנות על עבודה זו.
Materials
| JoVE 51922 MATERIALS | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
| 1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
| block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
| MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
Referenzen
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
