Un petit écran Molecule Manuel approchant à haut débit utilisant embryons de poissons zèbres

Génétique chimiques dans le poisson-zèbre peuvent avoir un impact critique sur la progression de la découverte de médicaments. Ce protocole fournit une méthode manuelle à haut débit pour effectuer la génétique chimique dans embryons de poisson zèbre avec un désir de lecture, permettant effectivement une équipe ou un petit de procéder à un petit écran de molécule. Cette méthode minimal des ressources étend la faisabilité de la génétique chimique à de nombreux groupes de recherche. Plus précisément, cette stratégie de l'écran offre une alternative importante à l'utilisation des instruments robotisés, de tels systèmes ne sont pas largement accessible à travers les départements de recherche. Cet écran permet à un seul manuel individuel pour tester une plaque de 96 puits de composés avec une lecture de WISH dans une semaine de travail de 6 jours. Depuis poisson zèbre sont ovipares, les embryons en développement en dehors de la mère, et les embryons sont assez grands pour voir à l'oeil nu (entre 1-3 mm), ils se prêtent à la manutention manuelle avec des instruments simples et le chercheur peut échantillons du tableau dansplaques multi-puits sans l'utilisation d'un microscope. En outre, étant donné que le poisson-zèbre développer rapidement, petite molécule exposition peut être efficace avec un seul traitement d'un composé, plutôt que des doses répétées, ce qui réduit en outre le traitement manuel. Embryons de poisson zèbre sont faciles à cultiver parce que leur jaune constitue une source de nutrition jusqu'à 5-6 jours après la fécondation, ce qui élimine la complication des alevins d'alimentation. En outre, la majorité des organes larvaires ont développé et devenir fonctionnel au cours de cette période, ce qui fournit l'occasion d'étudier un large éventail de questions de recherche. La simple addition de petites molécules aux médias embryon d'incubation est non-invasive et permet au chercheur (s) pour sélectionner pour la dose de médicament, moment de l'addition, et la durée de l'exposition ainsi fournir un contrôle serré sur de nombreuses variables et qui permettent au processus de développement spécifiques d'intérêt à être interrogé. Comme décrit ici, la productivité de recherche important peut être réalisé en un court timeframe en utilisant cette méthode manuelle de l'écran. Dans notre expérience, il ya un retour sur l'effort investi, ce qui peut être accentué en utilisant une bibliothèque chimique bioactive connu pour analyser un processus d'intérêt, tels que la segmentation des néphrons au cours du développement rénal (Figure 4; Poureetezadi et Wingert, non publié).

L'écran chimique manuel décrit ici est exceptionnellement polyvalent car il implique une analyse sur des échantillons de poisson zèbre fixes. Par exemple, cette stratégie peut être révisé à tester plusieurs plaques de composés dans une semaine, puis de marquer embryons la semaine suivante. Tests alternatifs sur des échantillons de poisson zèbre fixes, tels que l'immunohistochimie ou autre coloration des tissus préparations, pourraient également se substituer à la WISH lecture. Stratégies expérimentales pour réaliser des tests cellulaires chez le poisson zèbre sont adaptables en raison de la clarté optique et la transparence des premiers stades de développement. En outre, les chercheurs peuvent inhiber la pigmentation au plus tard stages utilisation de produits chimiques ou d'éviter la complication de développement de pigment totalement par l'utilisation de lignées génétiques pigments ou moins comme Casper pur poisson zèbre ^13. Il est possible d'administrer manuellement de petites molécules, de traiter la tache (s) d'intérêt, et de marquer manuellement embryons en utilisant un microscope stéréoscopique simple. Cependant, il est important de garder à l'esprit que l'analyse automatique de l'image pourrait être effectuée, et peut en fait être nécessaires pour l'analyse du phénotype de haute résolution. Par exemple, il peut être préférable de partenaire un système d'analyse d'image automatisée avec un dosage direct, comme un journaliste transgéniques, comme ce rationalise le traitement manuel des échantillons, quantifie les différences difficilement perceptibles à l'œil nu, et élimine les préjugés du chercheur ^15. Heureusement, certains systèmes d'imagerie automatisés sont à la fois économique et en termes de coûts de logiciels ¹⁵ convivial. L'utilisation et les capacités des autres systèmes automatisés ont rapidement évolué et peutêtre utilisé pour orienter les organismes, administrer des traitements médicamenteux, et même de déménager organismes ^12,15. Ces systèmes automatisés ont annoncé une nouvelle ère technologique de la recherche et ont fourni des solutions innovantes pour manipuler de grandes quantités de sujets de test et ainsi effectuer HTS et HCS approches dans des organismes entiers ^12,15. Bien que ces machines sont indéniablement des outils utiles, ils sont aussi très coûteux et sont hors de portée pour de nombreux laboratoires de recherche fondamentale. Sans accès à ces fonctionnalités automatisées, il peut sembler que les écrans chimiques ne sont pas possibles. Toutefois, ce protocole présente un guide pour savoir comment procéder à un écran manuel qui peut être utilisé pour compléter un écran génétique chimique d'une manière pratique sur une période de temps raisonnable.

Des inconvénients tant pour le dépistage et chimiques génétique manuels en général existent, et doivent être gardés à l'esprit lorsque l'on considère un écran chimique. En particulier, la méthode illustrée ici nécessite un degré modérédextérité physique. Cette préoccupation est réduite ou entièrement évité par la répétition, comme la dextérité sera améliorer avec la pratique. En outre, il ya place pour un minimum d'erreur grossière, car il ya seulement 10 embryons par puits pour l'analyse. Les petites molécules peuvent varier dans la pénétrance du phénotype qui est induite, si un régime raisonnable de marquer à identifier des composés d'intérêt doivent être respectées. Il est essentiel que les chercheurs utilisant ce protocole élaborer des critères suffisamment rigoureuses pour ce qu'ils vont envisager un succès. Il est également important de garder à l'esprit que la nature de cette forme de l'écran sera très probablement donner une certaine portion de faux positifs, qui peuvent être délimités par chimique autre traitement. En outre, il est essentiel de mettre en scène des embryons précisément et de recueillir embrayages pour le dépistage peu de temps après la fécondation, le développement asynchrone peut entraîner des complications à évaluer avec précision l'effet des traitements médicamenteux. En outre, en ce qui concerne le dépistage chimique comme un exstratégie expérimentale, il existe une multitude de limitations. Solubilité composé et la toxicité des molécules porteuses (par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO)) peuvent également présenter un problème et peuvent être prohibitifs pour tester de nombreuses molécules. Le chorion peut aussi agir comme barrière à l'exposition au médicament. Enfin, même si le poisson zèbre constituent un modèle puissant et translationnelle pour la génétique chimiques, il faut toujours être prise pour déterminer si une stratégie d'écran chimique de remplacement, par exemple, en utilisant un système in vitro comme une lignée cellulaire, peut être remplacé par l'utilisation de l'ensemble de les animaux. Néanmoins, le traitement chimique dans l'ensemble du système poisson-zèbre est jugé préférable de faire des approches similaires chez les mammifères, car il offre l'avantage de rassembler les effets systémiques des composés et peut permettre aux chercheurs de trier la liste des composés à tester dans un modèle mammifère.

À ce jour, les écrans chimiques du poisson zèbre ont fourni un puissant outil expérimental to définir les mécanismes de développement et de déterminer les agents pharmacologiques candidats pour une utilisation en médecine, tel que l'identification de molécules capables de prévenir les pathologies de la maladie. Par exemple, une étude de Burns et ses collègues ont développé un essai micro-puits automatisé de rythme cardiaque en utilisant embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP dans le myocarde ^42. Ils ont utilisé cette lignée transgénique pour analyser la fréquence cardiaque dans le développement et la façon dont il a été affecté à un traitement médicamenteux ^42. Une autre étude, en testant la densité de population de cellules souches hématopoïétiques dans l'embryon de poisson zèbre, a révélé que la prostaglandine E2 régule la niche HSC ^23. Ce constat a été validé chez la souris, et a ensuite été mis en œuvre pour les essais cliniques dans les greffes de cordon ombilical humain ^23,31-33 (NIH, clinique Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Grâce à plusieurs études récentes, la génétique chimique a prouvé pour être utile dans l'étude de la maladie du rein en utilisant le poisson zèbre <sjusqu'à> 43. Le rein poisson zèbre est un excellent paradigme pour étudier néphrogenèse ou régénération du néphron, l'unité fonctionnelle qui composent le rein au cours du développement et l'insuffisance rénale aiguë blessures ^43. la structure des néphrons est hautement conservée entre le poisson zèbre de rein embryonnaire et adulte des reins de mammifères ^44-50. Plusieurs études portant sur le rein embryonnaire du poisson zèbre illustrent clairement le potentiel de translation inhérente lorsqu'il est couplé avec la génétique chimiques. Un écran génétique chimique a été réalisée sur deux mutants de poisson zèbre qui ont été cartographiés à l'gènes PKD2 et ift172, qui sont connus pour être des acteurs clés dans la polykystose rénale (PKD) ^34. L'écran a abouti à l'identification de la déacétylase pan-histone (HDAC) trichostatine A (TSA) comme une petite molécule qui pourrait annuler les défauts morphologiques normalement observés dans les embryons mutants. Une approche différente adoptée par de Groh et collègues dépistage de composés qui INDUCed œdème de type sauvage embryons de poisson zèbre, ce qui indiquerait une perturbation de la fonction rénale ^35. Après avoir identifié PTBA comme un succès, ils ont observé que, en plus de provoquer un oedème, PTBA également augmenté l'expression de pax2a, un marqueur pour les progéniteurs du rein. Surtout, un dérivé optimisé de PTBA a ensuite été montré pour diminuer la mortalité pour cent de poisson zèbre adulte qui a subi des dommages aux reins de la gentamicine et de plus, accélère la récupération des souris qui ont souffert de lésions rénales ^27. Pris ensemble, ces contributions de la génétique chimiques de poisson zèbre présentent les types de découvertes qui peuvent être faites selon la méthode décrite dans ce protocole.

Alors que la recherche en génétique chimiques porte mérite considérable, il ne va pas sans certaines difficultés. Uniquement en utilisant une approche génétique chimique peut le rendre complexe à déterminer le ou les gènes spécifiques qui sont affectées par un composé. Même si une cible (s) est détectée, si ungnificant écart peut rester entre l'identification des composés et la compréhension du mécanisme (s) d'action dans lequel la petite molécule se comporte. Par exemple, il peut être difficile de déterminer le mécanisme par lequel une petite molécule agit en raison d'un seul composé est capable d'avoir une série d'effets différents au sein d'un organisme. Cependant, avec l'avènement des nouvelles technologies et plusieurs écrans génétiques chimiques en cours d'achèvement chez le poisson zèbre, le problème de la détermination d'un mécanisme est en baisse. Une méthode pour aider à déterminer les effets moléculaires des composés identifiés est de sélectionner une bibliothèque de médicaments de composés bioactifs connus pour le dépistage, où les mécanismes peuvent être potentiellement déduites des données déjà annotées. En outre, les algorithmes chemoinformatic, comme porte Discovery, sont disponibles pour l'utilisation qui peut comparer les similitudes structurelles d'un composé contre une base de données de composés avec des mécanismes attribuées ^14. Encore une autre manière à élucider le mécanisme d'un composé consisterait à générer une microarray profil après le traitement, puis interroger ce profil dans une compilation de profils pharmaceutiques des puces à ADN, comme Carte de la connectivité, la recherche de composés mécaniquement définies qui provoquent un effet similaire ^14. Cette approche peut également être utilisée pour identifier des mutants génétiques qui ont un effet similaire à celui du composé d'intérêt. Recherche d'une connexion entre un composé et un mutant pourrait suggérer que le composé moléculaire travaille en amont ou en aval du gène est associée, qui peut être délimitée par traitement des mutants avec le composé et morpholinos. Une autre option serait la spectrométrie de masse, qui continue à devenir plus optimisé pour le poisson-zèbre. Cette méthode peut être utilisée pour délimiter les modifications de protéines spécifiques ou de modifications post-traductionnelles après le traitement médicamenteux. Enfin, les petites molécules ou même des bibliothèques entières sont parfois capable d'être marquée pour déroulant de partenaires de liaison. Il est également intéressant de noter que, bien que le mécanisme de comment un petit fonctions de molécules is d'importance majeure, il existe des médicaments approuvés par la FDA pour qui les mécanismes restent inconnus.

Bien que le poisson zèbre présentent de nombreuses similitudes avec les mammifères à la fois génétiquement et physiologiquement, il ya encore un problème de drogue croisement ^14. Une étude a examiné la capacité de croisement des résultats à partir d'un écran d'inhibiteurs du cycle cellulaire dans ⁵⁰ embryons de poisson zèbre. L'écran a abouti à l'identification de 14 résultats qui étaient auparavant inconnu posséder une activité du cycle cellulaire. Sur ces 14 composés, 6 ont été révélés avoir une activité du cycle cellulaire dans les deux essais de culture de cellules humaines et de poisson zèbre, 3 ont été montré pour être sérum inactivé dans des essais de culture de cellules, 1 est actif uniquement dans les cellules de poisson zèbre, et 4 eu aucune activité dans les deux le poisson-zèbre ou des dosages de culture de cellules humaines, mais seulement dans l'ensemble de l'organisme du poisson zèbre. Notamment, les 4 composés que seulement avaient une activité dans le poisson-zèbre montrent qu'il existe des différences entre le poisson zèbre et les mammifères qui peuvent Matières interditesbit le potentiel de translation de certains composés. Ceci est une considération importante à garder à l'esprit, cependant, il existe des exemples de petites molécules, comme PGE ₂ qui amplifie la capacité des CSH à greffer des receveurs humains et PtBA dérivés qui améliorent le taux de récupération rénale chez les mammifères, fournissant ainsi la preuve de principe qui croisement est possible ^23,31-33.

Indépendamment de ces écueils, la génétique chimique et cette approche minimale des ressources a beaucoup à offrir à la communauté de recherche. Génétique chimique est particulièrement utile dans le poisson-zèbre et continueront à jouer un rôle crucial dans les interrogatoires de la voie moléculaire et la découverte de médicaments. écrans chimiques à base de cibles moléculaires discrètes ont toujours été soumis à un taux d'échec élevé en raison de ce qui est connu comme la constellation d'adsorption, distribution, métabolisme, excrétion, et toxicologiques (ADMET) propriétés ^51. Écrans chimiques en utilisant le poisson zèbre pourmettre l'accent sur un processus, plutôt que d'une cible discrète, peut contourner plusieurs problèmes ADMET et identifier des composés qui sont efficaces dans le contexte de l'ensemble de l'organisme. Avec la piscine de plus en plus de ressources disponibles pour la recherche du poisson zèbre, y compris des souches mutantes actuelles et la possibilité d'utiliser l'édition du génome à créer des mutants et transgéniques génétiques ciblées, il n'y a pratiquement un nombre illimité d'écrans génétiques chimiques potentiels en utilisant le poisson zèbre. Beaucoup de bibliothèques chimiques ont été organisée, et des collections de portée avec bioactifs connus, de nouveaux composés, de structures diverses et structurellement similaires. Ces réactifs offrent une multitude de possibilités intéressantes pour les combinaisons d'écrans qui sont actuellement disponibles et sont susceptibles de se développer dans les années à venir. Avec ces possibilités à la main, ce protocole manuel et à haut débit offre un moyen pratique et facile à utiliser pour augmenter la capacité des groupes de recherche à entreprendre écrans génétiques chimiques en utilisant le poisson zèbre.