Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish
Summary
O peixe-zebra é um excelente organismo experimental para estudar os processos de desenvolvimento de vertebrados e modelo da doença humana. Aqui, nós descrevemos um protocolo sobre como executar uma tela química Manual de alto rendimento em embriões de peixe-zebra com um todo-mount hibridização in situ (desejo) de leitura.
Abstract
Peixe-zebra tornaram-se um organismo modelo amplamente utilizado para investigar os mecanismos que estão por trás da biologia do desenvolvimento e estudar patologia da doença humana devido ao seu elevado grau de conservação genética com os seres humanos. Genética química envolve testar o efeito de que as moléculas pequenas têm em um processo biológico e está a tornar-se um método de investigação de translação populares para identificar compostos terapêuticos. Peixe-zebra são especificamente atraente para usar para a genética químicas devido à sua capacidade de produzir grandes garras de embriões transparentes, que são fertilizados externamente. Além disso, os embriões de peixe-zebra pode ser facilmente tratados com fármaco pela simples adição de um composto para a mídia embrião. Usando todo o monte de hibridização in situ (DESEJO), expressão de mRNA pode ser claramente visualizado dentro de embriões de peixe-zebra. Juntos, utilizando a genética químicos e desejo, o peixe-zebra torna-se um contexto organismo inteiro potente em que para determinar o celular e fisiológicaos efeitos de pequenas moléculas. Avanços inovadores têm sido feitos em tecnologias que utilizam procedimentos de triagem baseados em máquinas, no entanto, para muitos laboratórios de tais opções não são acessíveis ou permanecem custo proibitivo. O protocolo aqui descrito explica como executar uma tela genética manual de alto rendimento químico que requer recursos de base e pode ser realizado por um único indivíduo ou pequena equipe em um período eficaz de tempo. Assim, este protocolo proporciona uma estratégia viável que pode ser implementado por grupos de pesquisa para executar a genética químicos no peixe-zebra, o que pode ser útil para a obtenção de conhecimentos fundamentais em processos de desenvolvimento, mecanismos de doença, e para identificar novos compostos e as vias de sinalização que têm aplicações clinicamente relevantes .
Introduction
A identificação de drogas terapêuticas eficazes para tratar a doença humana é o fim do jogo para muitos pesquisadores da área biomédica. Enquanto a identificação e caracterização de potenciais agentes farmacológicos para aplicações clínicas tem valor óbvio para a saúde, ele permaneceu como um desafio significativo. Em última análise, o desenvolvimento de muitos compostos terapêuticos vem a partir do conhecimento de como os tipos de células específicas, quer desenvolver ou função. O peixe-zebra, Danio rerio, é um teleósteo de água doce da família Cyprinidae, que se tornou um modelo dominante organismo em biologia do desenvolvimento 1. Peixe-zebra são geneticamente vertebrados tratáveis que são fáceis de manter e manipular para estudos científicos 2,3. O embrião do peixe-zebra é transparente, fertilizado externamente, e pode ser produzido por centenas de um único par de acasalamento adulto em apenas uma semana 2,3. Além disso, os principais sistemas de órgãos de peixe-zebra partes e possuem uma grande degree de similaridade genética com os mamíferos, incluindo seres humanos 4. Surpreendentemente, 70% dos genes humanos têm um ortólogo 4 peixe-zebra. Devido a esta semelhança, peixe-zebra ter sido um sistema experimental altamente relevante para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento dos vertebrados e fisiologia, e têm sido empregados para recapitular uma multiplicidade de doenças humanas 5-7. Estas razões, entre outras, fizeram o peixe-zebra um candidato ideal para continuar interrogatórios genéticos e resultou em uma valorização cada vez maior para o utilitário de peixe-zebra na pesquisa biomédica 6,7.
Ao longo das últimas décadas, uma abundância de ferramentas genéticas têm sido desenvolvidos no peixe-zebra. O genoma do peixe-zebra é passível de mutagênese e transgênese 3. Até à data, uma pletora de estudos para a frente e reverso genéticas têm sido realizadas, conduzindo à geração de mais de 9.000 mutantes 3. Além disso, inúmeras linhagens transgênicas tem seen criado, que permitiram a rotulagem e isolamento de tipos específicos de células 3. Houve esforços significativos em curso para centralizar e distribuir esses recursos para a comunidade de pesquisa, que são acessíveis para os laboratórios em um relativamente baixo custo por meio do Centro Internacional de Recursos peixe zebra (Zirc) 8. Além disso, um extenso repositório de informação biológica e ferramentas moleculares, que vão desde padrões de expressão gênica para morfolino- sequências e protocolos, foram progressivamente anotada na Rede de Informação de peixe-zebra (ZFIN) 11/09. Estas infra-estruturas de investigação de peixe-zebra tem sido possível graças ao apoio significativo NIH e defesa deste modelo animal 8. Esse cache de mutantes de peixe-zebra, linhagens transgênicas, e informações pertinentes continua a ser de valor excepcional para a comunidade de pesquisa biológica em geral. No entanto, enquanto peixes-zebra são agora um organismo modelo bem estabelecido e pré-eminente, eles representam a largely reservatório inexplorado de estudar a biologia do desenvolvimento e da doença através do uso de telas genéticos químicos.
Genética química é o uso de pequenas moléculas, tais como fármacos ou outros compostos, para afectar um processo biológico dentro de um sistema de estar 12. Genética químicos podem ser implementadas para compreender os mecanismos moleculares da função do gene, tais como para identificar agentes que salvamento ou exacerbar um defeito genético específico de 12. Além disso, a genética químicos representa uma importante avenida para realizar pesquisa translacional 12. Enquanto telas genéticos para a frente tradicionais em modelos animais têm sido tremendamente poderoso na ligação entre genes específicos a doenças, falta-lhes uma dimensão temporal, tornando difícil ou mesmo impossível de observar fenótipos que surgiriam após a embriogênese. Além disso, a redundância gene pode fazer dos resultados obtidos com a genética para a frente de difícil interpretação. Alternativamente, telas genéticos químicospermitir o controle temporal bem e, simultaneamente, proporcionar um valioso ponto de partida para a descoberta de medicamentos 12,13.
Genética químicos podem ser realizados utilizando sistemas in vitro (por exemplo, linhas celulares, proteínas) ou utilizando um sistema in vivo, tal como um organismo inteiro. Usando um sistema in vitro para a genética químicos pode ser benéfico, pois é mais simples do que um sistema organismo inteiro, mais fácil de trabalhar com a grande escala, menos dispendiosa e menos demorada. Como resultado, os sistemas in vitro, tanto para permitir que a triagem de alto rendimento (HTS) e um rastreio de alto-teor (HCS). Há um número de vantagens de se utilizar um sistema in vitro que devem ser considerados quando se aproxima genética químicos, mas também limitações significativas. Uma limitação importante ao uso de uma linha celular é que as moléculas pequenas podem ser eficaz e não tóxica de uma linha celular específica, mas tornam-se tóxicos quando introduzido num organismo inteiro. Assim, o cerneda questão é que os sistemas in vitro não captam o amplo contexto de um organismo e, portanto, nem sempre são capazes de imitar com precisão o que acontece em um organismo inteiro. Embora o teste composto em organismos inteiros pode contornar esses problemas, o uso de modelos de mamíferos organismo inteiro apresenta uma série de limitações físicas e éticas. Por exemplo, a seleção da droga no mouse é logisticamente prejudicado pelo espaço e os custos necessários para testar uma amostra de dimensão adequada. Além disso, as questões de desenvolvimento podem ser difíceis de estudar, devido ao fato de que os mamíferos desenvolver no útero. Finalmente, embora a conduta da pesquisa biomédica tem valor social imenso, há, no entanto, as necessidades substanciais para proteger bem-estar animal, limitando intensos estudos e aliviar a dor eo sofrimento dos animais utilizados para pesquisa. Zebrafish proporcionar um substituto viável para trabalhar com os vertebrados superiores, como mamíferos, e, além disso, muitos temas podem ser estudados utilizando a genética químicos noos estágios embrionários e larvais quando o processamento neurológico está ausente ou operativa em um nível baixo 12,13.
Até à data, uma miríade de telas genéticos químicas foram realizadas utilizando embriões de peixe-zebra, em particular, como a entrega composto pode ser realizado por imersão embriões em meios contendo a droga de interesse 12-15. Além disso, tem havido inúmeros avanços científicos e tecnológicos para fazer telas genéticos químicos possível e gerenciável 16-20. Peterson e seus colegas foram os primeiros a usar peixe-zebra em uma tela genética química em 2000, e mais tarde, em 2004, identificou um composto que suprimiu uma mutação CoAo em peixe-zebra 21,22. Telas químicos já foram implementadas para estudar vários tecidos em desenvolvimento (por exemplo, o coração, sangue, vasos) 23-25, funções fisiológicas (por exemplo, bases neurológicas para o comportamento) 26, a regeneração adulto 27,28, e diseas modelos eletrônicos (por exemplo, distrofia muscular e câncer) 29,30. De entre essas telas químicas peixe-zebra, a descoberta de que as prostaglandinas regular as células-tronco hematopoiéticas foi levado para testes clínicos em humanos, demonstrando o poder de mover-se de "tanque de cabeceira" 23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Mais recentemente, prometendo terapêutica candidatos surgiram para órgãos complexos como o rim, que remediar patologia celular na doença renal policística (PKD) 34 e lesão renal aguda 27,35, embora estes ainda têm de se deslocar para ensaios clínicos. Estas telas genéticos químicos amplamente demonstrar a utilidade de testar compostos pequenos no peixe-zebra desenvolvimento ea capacidade de aplicar genética químicos para interrogar a função do tecido adulto. Além disso, há uma lista crescente de coleções de farmacologia comercialmente disponíveis que estão disponíveis para estudos acadêmicos 19.
ove_content "> Nos últimos anos, houve avanços importantes na tecnologia química triagem genética, incluindo a utilização de sistemas automatizados de robôs para dispensação e manipulação de medicamentos, juntamente com sistemas de imagem automatizados 36-38. Tais sistemas permitem a possibilidade de testar milhares de compostos para alcançar ambos os HTS e HCS 36-38. Infelizmente, a empresa de telas genéticos químicos com estas empresas robóticas inovadoras geralmente exigem recursos consideráveis. Estes tipos de recursos são um entrave significativo para muitas instituições que não possuem o capital para adquirir , operar e manter tal instrumentação. Ao estabelecer a infra-estrutura para o manuseio robótico de bibliotecas químicas, incluindo a transferência de embriões para vestidos placas, permanece custo proibitivo para muitos laboratórios, tratamento de imagens e análise automatizada é geralmente mais acessível 12. screening imagem automatizada permite a quantificação de re transgénico fluorescenteporteiros e facilita a análise fenotípica específica 12,15.Embora os sistemas automatizados representam avanços tecnológicos úteis, muitas questões podem ser abordadas por telas manuais mais focadas, como a consulta de vários milhares de compostos biologicamente ativos em um processo de desenvolvimento com um conjunto de montagem de hibridização in situ (desejo) de leitura 39. Além disso, enquanto um número crescente de laboratórios invocaram telas químicas peixe-zebra para investigar uma questão de pesquisa, poucos saturação (se houver) esforços têm alcançado e muitos temas ainda têm que ser quebrado usando a genética químicos. Telas químicos podem ser executados usando uma pequena colônia de peixe-zebra que consiste em apenas alguns tipo selvagem ou tanques de transgênicos. Portanto, essa forma de interrogatório genética deve ser atingível pela maioria dos grupos de pesquisa do peixe-zebra interessados em expandir / diversificação para esta arena. Bibliotecas químicas de tamanhos variados podem ser adquiridos a partir de um distribuidor comercial e / ou collaborators. Por estas razões, a genética químicos pode ser economicamente viável, mesmo em climas de financiamento duras. No entanto, existem obstáculos para começar uma tela genética químicos, tais como a forma de planejar os aspectos logísticos da tela: por exemplo, o número de pessoal necessário para uma tela bem sucedida, a colocação de tempo dedicada e montando um protocolo físico manualmente amostras de processo o número das centenas a vários milhares. Aqui, nós pormenor um protocolo de alto rendimento manual para realizar genética químicos no embrião do peixe-zebra com o desejo como uma leitura. Este método envolve o tratamento de embriões de peixes-zebra de droga, seguida por detecção ribossonda de transcritos de mRNA. Usando este protocolo, uma pequena equipe ou mesmo um indivíduo pode razoavelmente tela e analisar uma biblioteca química modesto aproximadamente 600 compostos no período de 9 semanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genética químicos no peixe-zebra pode ter um impacto crítico sobre a evolução da descoberta de medicamentos. Este protocolo fornece um método de alto rendimento manual para realizar genética em embriões de peixe-zebra químicos com um desejo de leitura, de forma eficaz permitindo um indivíduo ou pequena equipe para realizar uma pequena tela molécula. Este método mínima estende-recurso a viabilidade da genética químicos de muitos grupos de investigação. Especificamente, esta estratégia tela fornece uma alternativa importante para o uso de instrumentação robótica, como tais sistemas não são amplamente acessíveis em todos os departamentos de pesquisa. Esta tela Manual permite que um único indivíduo para testar uma placa de 96 poços de compostos com uma leitura DESEJO em uma semana de trabalho de 6 dias. Desde peixe-zebra são ovíparos, com os embriões em desenvolvimento fora do pais, e os embriões são grandes o suficiente para ver a olho nu (entre 1-3 mm), eles são passíveis de tratamento manual com instrumentos simples e o pesquisador pode amostras de matriz emplacas multi-poços sem o uso de um microscópio. Além disso, como peixe-zebra se desenvolvem rapidamente, pequena molécula de exposição pode ser eficaz com um único tratamento de um composto, em vez de doses repetidas, o que minimiza ainda mais o processamento manual. Embriões de peixe-zebra são facilmente cultivadas porque sua gema é uma fonte de alimentação até 5-6 dias após a fertilização, o que elimina a complicação de alevinos de alimentação. Além disso, a maioria dos órgãos de larvas desenvolveram-se e tornar-se funcional durante este período, o que proporciona a oportunidade de estudar uma grande variedade de questões de pesquisa. A simples adição de moléculas pequenas para o meio de incubação de embriões é não-invasiva e permite ao pesquisador (s) para seleccionar, para a dose da droga, o tempo de adição e da duração da exposição, assim, proporcionando um controlo apertado sobre muitas variáveis e permitindo que os processos de desenvolvimento específicos de juros a ser consultado. Conforme descrito aqui, a produtividade de pesquisa significativa pode ser alcançada em um curto timeframe utilizando esta metodologia tela manual. Em nossa experiência, há um alto retorno sobre o esforço investido, que pode ser acentuada por meio de uma biblioteca química bioativa conhecido para analisar um processo de interesse, tais como a segmentação de néfrons durante o desenvolvimento renal (Figura 4; Poureetezadi e Wingert, não publicado).
A tela química manual descrita aqui é excepcionalmente versátil, pois envolve um ensaio em amostras de peixe-zebra fixos. Por exemplo, esta estratégia pode ser revista para testar várias placas de compostos em uma semana e, em seguida, para marcar embriões na semana seguinte. Ensaios alternativos em amostras de peixe-zebra fixos, tais como coloração imuno-histoquímica ou outro tecido preparações, também pode ser substituído por o desejo de leitura. Estratégias experimentais para realizar ensaios celulares em peixe-zebra são adaptáveis devido à claridade óptica e transparência dos primeiros estágios de desenvolvimento. Além disso, os pesquisadores podem inibir a pigmentação na tarde stages uso de produtos químicos ou evitar a complicação de desenvolvimento pigmento completamente através do uso de linhas genéticas-pigmento menos como casper ou pura zebrafish 13. É possível administrar manualmente pequenas moléculas, processar a mancha (s) de interesse, e para marcar manualmente embriões utilizando uma lupa simples. No entanto, é importante ter em mente que a análise de imagem automatizada pode ser realizada, e pode de facto ser necessário para análise de fenótipo alta resolução. Por exemplo, pode ser preferível para parceiro de um sistema de análise de imagem automatizada, com um ensaio directo, tal como um repórter transgénico, como esta simplifica o processamento manual das amostras, quantifica as diferenças não são facilmente discerníveis a olho nu, e elimina pesquisador viés 15. Felizmente, alguns sistemas de imagem automáticos são ambos amigável e econômica em termos de custos de software 15. O uso e capacidades de outros sistemas automatizados têm evoluído rapidamente e podeser usado para orientar os organismos, administrar tratamentos com drogas, e até mesmo para mudar organismos 12,15. Estes sistemas automatizados ter anunciado uma nova era tecnológica de investigação e de ter fornecido soluções inovadoras para manipular grandes quantidades de assuntos de teste e, assim, realizar HTS e HCS abordagens em organismos inteiros 12,15. Embora tais máquinas são inegavelmente ferramentas úteis, eles também são muito caros e estão fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa básica. Sem o acesso a estes recursos automatizados, pode parecer que as telas químicas não são possíveis. No entanto, este protocolo descreve um guia de como realizar uma tela manual que pode ser usado para completar uma tela genética química de uma forma prática ao longo de um período de tempo razoável.
Existem desvantagens para ambos os de triagem e químicas genética manuais em geral, e deve ser mantido em mente quando se considera uma tela química. Em particular, o método demonstrado aqui exige um grau moderadode destreza física. Esta preocupação é diminuída ou totalmente evitado através da repetição, como destreza irá melhorar com a prática. Além disso, há espaço mínimo para erro grosseiro, uma vez que existem apenas 10 embriões por bem para análise. Pequenas moléculas podem variar de penetrância do fenótipo que é induzida, portanto, um regime de pontuação razoável para identificar compostos de interesse devem ser respeitados. É vital que os pesquisadores que utilizam este protocolo elaborar critérios adequadamente rigorosos para o que eles vão considerar um sucesso. É também importante ter em mente que a natureza desta forma de tela provavelmente irá produzir uma certa porção de falsos positivos, o que pode ser ainda mais demarcados química work-up. Além disso, é crítica para a fase precisamente embriões e para recolher garras para triagem logo após a fertilização, como o desenvolvimento assíncrona pode levar a complicações para avaliar com precisão o efeito de tratamentos com drogas. Além disso, no que diz respeito ao rastreio químico como um experimental estratégia, há uma série de limitações. Composto solubilidade e toxicidade das moléculas transportadoras (por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO)) também pode apresentar um problema e pode ser proibitivo em testar muitas moléculas. O córion também pode atuar como barreira à exposição da droga. Finalmente, apesar do peixe-zebra é um poderoso modelo e de translação para a genética químicas, cuidado deve ser sempre levada ao determinar se uma estratégia alternativa tela química, por exemplo, utilizando um sistema in vitro, tais como uma linha celular, pode ser substituído pelo uso de toda animais. No entanto, o tratamento químico em todo o sistema do peixe-zebra é considerada preferível para a realização de abordagens semelhantes em mamíferos, uma vez que proporciona a vantagem de reunir os efeitos sistémicos dos compostos e pode permitir aos investigadores para fazer a triagem da lista dos compostos a serem testados em um modelo de mamífero.
Até à data, as telas de peixe-zebra químicos têm fornecido uma ferramenta poderosa t experimentalo delinear os mecanismos de desenvolvimento e para verificar agentes farmacológicos candidatos para uso em medicina, tais como a identificação de moléculas capazes de prevenir patologias de doenças. Por exemplo, um estudo realizado por Burns e seus colegas desenvolveram um ensaio micro-bem automatizado para a frequência cardíaca utilizando embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam GFP no miocárdio 42. Eles usaram esta linhagem transgênica para analisar a freqüência cardíaca em desenvolvimento e como ela foi afetada após o tratamento medicamentoso 42. Outro estudo, testando a densidade populacional de células-tronco hematopoéticas no embrião de peixe-zebra, identificou-se que a prostaglandina E2 regula o nicho HSC 23. Este achado foi validado no rato, e mais tarde foi implementado para testes clínicos em humanos transplantes de cordão umbilical 23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Através de inúmeros estudos recentes, a genética químicos tem provado ser útil no estudo da doença renal utilizando o peixe-zebra <saté> 43. O rim do peixe-zebra fornece um excelente paradigma para estudar nefrogênese ou regeneração do nefrónio, a unidade funcional que compreendem o rim durante o desenvolvimento e lesão renal aguda 43. Nephron estrutura é altamente conservada entre o rim embrionário do peixe-zebra e o rim de mamífero adulto 44-50. Vários estudos examinaram a rim de embrião de peixe-zebra ilustram claramente o seu potencial translacional inerente quando juntamente com a genética químicos. Uma tela genética química foi realizada em dois mutantes de peixe-zebra que foram mapeados para a PKD2 e ift172 genes, que são conhecidos por serem os principais intervenientes na doença renal policística (PKD) 34. A tela resultou na identificação da desacetilase de histona-panela (HDAC) inibidor tricostatina A (TSA) como uma pequena molécula que podem anular os defeitos morfológico normalmente vistos nos embriões mutantes. Uma abordagem diferente tomada por de Groh e colegas selecionados para compostos que Inducedema ed em embriões de peixe-zebra do tipo selvagem, o que indicaria uma perturbação da função renal 35. Depois de identificar PTBA como um sucesso, eles observaram que para além de causar edema, ABT também aumentou a expressão de pax2a, um marcador para células progenitoras renais. É importante ressaltar que um derivado otimizado de PTBA foi então mostrado para diminuir a porcentagem de mortalidade de peixe-zebra adulto que sofreu lesão renal induzida por gentamicina e, além disso, acelerou a recuperação de ratos que sofriam de dano renal 27. Tomados em conjunto, estes contribuições de genética química de peixe-zebra mostrar os tipos de descobertas que podem ser feitas utilizando o método descrito no presente protocolo.
Embora a genética químicos pesquisa traz mérito substancial, não é sem alguns desafios. Unicamente utilizando uma abordagem genética químicos pode tornar complicada para determinar o gene ou genes específicos que estão a ser afectadas por um composto. Mesmo se um alvo (s) é encontrado, um significant lacuna pode permanecer entre a identificação de compostos e a compreensão do mecanismo (s) de acção em que a pequena molécula comporta. Por exemplo, ela pode ser difícil de determinar o mecanismo em que uma molécula pequena, porque está a actuar um único composto é capaz de ter uma gama de efeitos diferentes dentro de um organismo. No entanto, com o advento de novas tecnologias e telas genéticos mais químicos em fase de conclusão no peixe-zebra, o problema de determinar um mecanismo está encolhendo. Um método para ajudar a determinar os efeitos moleculares de compostos identificados consiste em seleccionar uma biblioteca de fármacos de bioactivos conhecidos para triagem, onde os mecanismos pode ser deduzida a partir de dados potencialmente anteriormente anotados. Além disso, os algoritmos chemoinformatic, como Descoberta portão, estão disponíveis para o uso que se possa comparar semelhanças estruturais de um composto contra um banco de dados de compostos com mecanismos atribuídos 14. Ainda outra maneira para elucidar o mecanismo de um composto seria gerar uma microarray perfil após o tratamento e, em seguida, consultar este perfil em uma compilação de perfis de drogas microarray, tais como conectividade Mapa, em busca de compostos mecanicamente definidas que provocam um efeito semelhante 14. Esta abordagem também pode ser utilizada para identificar mutantes genéticos que têm um efeito semelhante como o composto de interesse. Encontrar uma conexão entre um composto e um mutante possa sugerir que o composto funciona molecularmente a montante ou a jusante do gene relacionado, que pode ser delineada por tratamento dos mutantes com o composto e morpholinos. Outra opção seria a espectrometria de massa, que continua a tornar-se mais otimizada para peixe-zebra. Este método pode ser usado para delinear mudanças específicas de proteínas ou modificações pós-traducionais de drogas após o tratamento. Finalmente, pequenas moléculas ou mesmo bibliotecas inteiras são, por vezes, capaz de ser marcado para pull-down de parceiros de ligação. Também vale a pena notar que, embora o mecanismo de como uma pequena molécula funciona is de importação significativa, existem medicamentos aprovados pela FDA para o qual os mecanismos permanecem desconhecidos.
Apesar de peixe-zebra apresentam muitas semelhanças com os mamíferos, tanto geneticamente e fisiologicamente, ainda há um problema de passagem de droga 14. Um estudo investigou a capacidade de cruzamento dos hits de uma tela de inibidores do ciclo celular em embriões de peixe-zebra 50. A tela resultou na identificação de 14 hits que eram previamente desconhecido para possuir actividade do ciclo celular. Fora desses 14 compostos, 6 revelaram ter actividade do ciclo celular em ambos os ensaios de cultura de células humanas e de peixe-zebra, 3 mostraram-se soro inactivado em ensaios de cultura de células, foi de 1 activo apenas em células de peixe-zebra, e 4 não teve actividade em nenhum peixe-zebra ou ensaios de cultura de células humanas, mas apenas em todo o organismo do peixe-zebra. Notavelmente, os quatro compostos que só tiveram a atividade no peixe-zebra demonstrar que existem diferenças entre os peixes-zebra e mamíferos que podem prohimordeu o potencial translacional de certos compostos. Esta é uma consideração importante a ter em consideração, no entanto, há exemplos de pequenas moléculas, como PGE 2, que amplia a capacidade de HSCs para enxertar em receptores humanos e ABT-derivados que melhoram a taxa de recuperação renal em mamíferos, proporcionando assim a prova do princípio de que o cruzamento é possível 23,31-33.
Independentemente dessas armadilhas, genética químicos e esta abordagem mínima de recursos tem muito a oferecer a comunidade de pesquisa. Genética química é particularmente útil no peixe-zebra e vai continuar a desempenhar um papel crítico na via molecular de interrogação e de descoberta de fármacos. Telas químicos baseados em alvos moleculares discretas têm sido historicamente sujeitos a uma elevada taxa de insucesso devido ao que é conhecido como a constelação de adsorção, distribuição, metabolismo, excreção, e toxicológicos (ADMET) Propriedades 51. Químicas do peixe-zebra utilizando telas defocar um processo, em vez de um alvo discreto, pode contornar problemas vários ADMET e identificar compostos que sejam eficazes no contexto de todo o organismo. Com o aumento do pool de recursos disponíveis para a pesquisa do peixe-zebra, incluindo cepas mutantes atuais ea capacidade de utilizar a edição genoma para criar mutantes genéticos direcionados e transgênicos, há praticamente um número ilimitado de potenciais telas químicas genéticos usando zebrafish. Muitas bibliotecas químicas foram curadoria, coleções e span com bioativos conhecidos, novos compostos, estruturalmente diversas e estruturalmente semelhantes. Estes reagentes fornecer uma riqueza de oportunidades para combinações de ecrãs que estão atualmente disponíveis e tendem a crescer ainda mais nos próximos anos. Com estas possibilidades na mão, este protocolo manual e de alto rendimento fornece uma maneira prática e fácil de usar para aumentar a capacidade de grupos de pesquisa para empreender telas genéticos químicos usando zebrafish.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para o laboratório de pesquisa Wingert a partir do seguinte: Institutos Nacionais de Saúde concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor arranque Scholar concessão de uma subvenção # 5 FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame College of Science e do Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa oferta para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para promover investigação em células estaminais. Os financiadores não tinham qualquer papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos Paul T. Kroeger, Jr. para fornecer feedback crítico sobre o manuscrito. Agradecemos ao pessoal do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa de peixe-zebra em Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia peixe-zebra. Por fim, agradecemos aos membros da nossa pesquilaboratório ch por seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho.
Materials
| JoVE 51922 MATERIALS | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
| 1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
| block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
| MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
Referenzen
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