手册小分子屏幕接近高通量使用斑马鱼胚胎

该程序在这里描述的斑马鱼工作在Notre Dame大学被批准的实验动物管理和使用委员会。的研究设计的导向为在斑马鱼本说明书小分子屏幕设置（ 图1）。在这个协议中所描述的方法的概述被提供为一个流程图（ 图2）。请参考示例标记系统（ 图3）来计划部件4-10中描述的胚胎处理步骤。对胚胎的分期，请参阅斑马鱼分段系列40，和用于制备在零件9-10使用WISH反义核糖核酸探针，指最近发表的方法41。 1.准备斑马鱼交配商会将一个成年男性斑马鱼和一个成年雌性斑马鱼成交配室，由室分O / N分开。 注：质量交配，这样的š那些使用组2-3雌性和雄性2-3相比单一配对交配能产生更多的胚胎，并且可以与适当大小的配合腔室中进行。 重复步骤1.1中，使得总共25对斑马鱼的是设置为每96孔板的小分子，将被测试。 2.收集斑马鱼胚胎第二天，删除分隔每条鱼对分频器和1小时后，用细网过滤收集斑马鱼胚胎，并将其放置在含有E3胚胎培养基（见配方物料清单）的培养皿。 注：收集胚胎后1小时可确保胚胎正处于相似的发展阶段。 使用塑料移液管，以清除杂物（ 如食品和固体废弃物）。接下来，使用立体显微镜，观察胚胎的各离合器和删除任何未受精的卵子。 倒出的E3胚胎培养基，换上新鲜的E3，然后将每个迪SH在28.5℃培养箱中培养胚胎。 2小时后观察使用立体显微镜胚胎各离合器和删除任何未受精的卵子。 注：未受精的卵子会毒害其他胚胎，并似乎在单细胞阶段或不透明。 继续监测胚胎的使用立体显微镜，直到他们达到40％外包的发展进步。观察看起来在40％外包阶段40所组成的两个单独的层的胚胎的球体形状。 3.化学稀释准备除去化学文库板从存储在-80℃下，用铝箔覆盖，并在室温下解冻。 注：不同的库将在解冻主要取决于溶剂不同速率被使用。通常情况下，冷冻于-80℃的化学品库将完全在大约3小时，在室温解冻。商店解冻板（S）在一个安全的位置，与相应的危险品标签。穿ppropriate眼镜，实验室外套，和处理化学药品时，两套手套。 使用一个8通道多通道移液管加入99微升的E3成列的96孔板的2-12。 注意：根据我们的经验，合适的起始药物的范围是介于10微米- 50微米，并且还作为在当前的协议39进行说明。在这里，我们展示了一个10微米的治疗，如果采用1毫米的化学库中的股票板块。 使用一个8通道多通道移液管加入1μl的各化合物的其各自的井与E3。 使用P10到吸管1微升DMSO中（或适当的溶剂中）到控制列（在此为第12列）。 覆盖化学稀释板用铝箔，作为铝箔会保护在库中的任何光敏化合物，并在库存化学文库板返回到-80℃下贮存。 4，组阵斑马鱼胚胎选择一个培养皿含斑马鱼胚胎在40％外包阶段。使用移液管小心地放入大约10胚的（1.1毫升）中的每个孔深孔96孔板内。分配胚胎成列的深96孔板的2-12。 注：研究者应该选择最好适合他们希望询问的发展过程中药品加成的时间点。使用塑料移液管，可最大限度地减少胚胎停育。由于药物治疗之前，40％的外包可能会导致增加胚胎致死，发展胚胎再之前的药物暴露，尤其是当后来的发展进程正在审查。放置超过15-20胚胎在每个孔可导致发育迟缓由于拥挤而应当避免。值得注意的是，深96孔板中含有胚胎是来自化学稀释的96孔板的不同是很重要的。 使用玻璃移液管从每个很好地去除多余的E3，排出多余的E3成液体废物容器。 注：此过程通常需要30分钟到1小时根据研究者的速度，因此胚胎是在50％和60％的外包被完成，这是因为除了在这里所描述的化学稀释的目标发展阶段。该板可以在45°角倾斜，以使胚胎下降到井的底部，以使移液管的尖端可以针对井的底部被压吸去多余的E3。 5.添加化学处理的使用一个8通道多道移液器在深96孔板中含排列的斑马鱼胚胎中加入100μl稀释化学品转移到他们各自的水井。 注：请确保该化合物的原井位，在相应的深96孔板（ 例如 ，在化学稀释板B1井位被吸取到B1井位在深的井位匹配96孔板）。 湿纸巾，把它变成一个感光容器足够大，可以容纳96孔板。 注：湿纸巾将有助于防止化学品稀释液蒸发。 接下来，使用密封垫密封深96孔板，将其放入感光容器中，在28.5℃的孵化了。 注：让斑马鱼的胚胎发育，直到第二天早上。或者，使胚胎发育直到用于过程中的适当的发育阶段被分析。 6.去除化学品使用一个8通道多通道移液管加入300微升的E3对药物处理的孔中的每一行。抽出，并丢弃从每排的E3 /化学稀释。用300微升E3洗胚胎3次。 注：丢弃药物浪费在仅用于该目的的标记的容器。为了便于洗涤的，用充满E3玻璃盆足够宽，能够使用MULTichannel吸管。 7.链霉蛋白酶和固定斑马鱼胚胎传输使用塑料移液管斑马鱼胚胎成4个24孔板中，然后取出所有死胚。标记24孔板中，使它们对应于原药以及位置。发生在一个黑暗的背景前移液器每孔转移后以可视化的吸管的胚胎，防止胚胎以及交叉。 使用塑料移液管吸去E3以便将胚勉强浸没在液体中。 使用玻璃吸管〜2滴的链霉蛋白酶的股票（50毫克/毫升）添加到每个孔中。让胚培养在链霉蛋白酶处理5分钟，然后搅拌该孔中，以使绒毛掰开。备选地，链霉蛋白酶的胚胎它们在用于分析所需的发育阶段之前。 使用塑料移液管与E3洗两次胚胎。 一旦胚胎是在分析中，排版所需阶段letely抽出并丢弃其余的E3。 使用塑料移液管添加新鲜的4％PFA / PBS中，以每个孔中。孵化的胚胎在4°CO / N来解决。用刚解冻的PFA初步修复的胚胎。 注：继续执行您感兴趣的屏幕检测。这里详细介绍第8-10是一个过程来处理筛板与心愿。可供选择的方法，可以被取代的如需要的话，然后进行第11节和评估结果。 8.胚胎通透使用塑料移液管，以排出物的4％PFA / PBS中的胚胎，并用1×两次洗涤胚胎（磷酸盐缓冲盐水与吐温）的PBST。胚胎转移到48孔板中，然后从胚胎抽出的1×PBST中。标记48孔板中，以匹配深96孔板的原井的位置。 用塑料移液管吸取，然后它关闭，并添加100％methano添加100％甲醇的洗井升再次向胚胎。 将胚胎在-20℃下，孵育至少20分钟。可替换地，保持在100％甲醇中的胚胎，在-20℃下长期储存。 除去100％的甲醇中并用50％甲醇/ 1×PBST中，然后在30％甲醇/ 1×PBST洗涤胚胎，最后两次用1×PBST中。 注：胚胎年龄超过24小时，受精后（高倍视野）可以在此时被漂白以除去色素39。 加入15微升的解冻蛋白酶K的库存（10毫克/毫升）至50ml 1×PBST中以制备蛋白酶K（5微克/毫升）的工作溶液。 从胚胎中取出1×PBST中，并添加蛋白酶K工作溶液。 4分钟后取出蛋白酶K。 注：实验者应在该步骤中，以防止胚胎降解迅速工作。蛋白酶K的浓度和温育时间需要根据胚胎的年龄被处理41来改变。这里所述的参数涉及胚胎这是24 HPF。 洗1X PBST胚胎，再加入冰冷的4％PFA / PBS。让胚胎孵育在4％PFA / PBS中20分钟，在RT。 9.杂交和探针移除使用玻璃移液管取出4％PFA / PBS和1X PBST洗两次胚胎。替换为1倍的PBST用500μlHYB +的孵育胚胎4小时，在70℃。 注意：预杂交可为少至2小时来进行的，但4小时是理想的。此外，不同的杂交和洗涤温度可以是适合于特定的探针，例如65℃，但在个人基础上应进行测试。 生成对应于感兴趣41的基因（多个）地高辛标记的核糖核酸探针。 加入16微克核糖核酸探针来16毫升HYB +的。在使用前预先温热的核糖核酸探针/ HYB +溶液在70℃下进行至少20分钟。如果使用多个探针，每个探针加16微克到相同的HYB +卷（16毫升）中。 使用玻璃移液管，去除HYB +，并使用P1000上添加200微升的核糖核酸探针/ HYB +混合物。倒置核糖核酸探针/ HYB +鸡尾酒使用和吸管起来之前和之后加入该混合物到每个孔中向下一次。使用屏障枪头添加核糖核酸探针/ HYB +解决方案，这样可以防止混合气进入吸管。 孵育中的核糖核酸探针/ HYB +鸡尾酒的胚胎在70°CO / N。使用的粘合剂膜，以覆盖板孔的O / N探针保温和以下所有热洗涤的。 准备50％甲酰胺/ 2×SSCT，2个SSCT和0.2X SSCT和预暖在70°CO / N。 使用P1000，除去核糖核酸探针/ HYB +和在-20℃下将混合物储存。 （可选），再使用多达三倍的riboprobe / HYB +混合。之前，每个重复使用，在3微克核糖核酸探针的添加到原始riboprOBE / HYB +混合。 用玻璃移液管，两次，用50％甲酰胺/ 2×SSCT在70℃下洗涤胚胎30分钟。一旦用2×SSCT 15分钟，在70℃下洗涤胚胎。在70℃下用0.2×SSCT两次洗涤胚胎30分钟。取出0.2×SSCT并在室温洗MABT胚胎的两倍。 10.抗地高辛抗体孵育和检测使用玻璃移液管，从每个孔中取出MABT。使用塑料移液管中，添加新鲜块溶液到每个孔中。让胚胎在孵育块4小时在室温。加入8μl的抗洋地黄毒苷抗体的40毫升块溶液（5000倍稀释）。 使用塑料移液管，代替与抗体/块解块溶液。添加足够的抗体/块溶液完全覆盖胚胎。 覆盖48孔平板用铝箔，使得没有光可以通过穿透到细胞胚。公司乌瓦特胚胎O / N在4℃。用玻璃移液管，取出抗体/块溶液和洗涤胚胎10次MABT为每次5-10分钟。 注：MABT洗液可以连续地进行，因为它会采取研究者5-10分钟，从各板去除MABT和分配清新MABT入井。 生成的预染色缓冲液以40ml（80毫升数量）两个管。添加180微升的NBT（50毫克/毫升）和140μl的BCIP（50毫克/毫升），以预染色缓冲液制备的管中的一个来创建该染色溶液。 注：此染色溶液将产生紫色着色基板。 代替预染色缓冲的MABT并让胚在室温下孵育5分钟。 更换预染色缓冲液用染色溶液，并在室温离开。监测比色反应用立体显微镜每15分钟。 注：染色反应可以从几分钟到取决于探头许多小时。 众议员花边用1×PBST将染色溶液后的染色反应完成，然后用1×PBST洗两次胚胎5分钟。 取出1X PBST并添加4％PFA / PBS固定的胚胎。 注意：可替换地，执行双WISH检测核糖核酸探针的标记与抗荧光素抗体。如果执行双重原位 ，则跳过加入1×PBST洗涤（步骤10.8）在4％PFA / PBS中（步骤10.9）中并用MABT洗涤用0.1M甘油洗两次胚胎15分钟，两次，每次15分钟，然后孵化的胚胎在块30分钟。然后使用正确的染色液中添加了正确的抗体，O / N和执行步骤10.3-10.9。为了检测荧光素标记的核糖体探针，制备具有BCIP和INT染色液，观察红色衬底（参见步骤10.1）。 11.计分的化学屏幕胚胎板使用立体显微镜来评估胚胎SAMPL执行结果的视觉评分ES在表型检测。 使用塑料移液管，从48孔板转移胚胎到12孔板上以获得最佳的可视化。标记12孔板中，使它们对应于从原来的深96孔平板中的井位。当传输完成后，查看了体视显微镜下。 注：代表性的胚胎可以从12孔平板中进行选择，并在盖玻片41成象在载玻片上。