دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة
Summary
الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في القراءة خارج.
Abstract
أصبحت الزرد نموذج كائن يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الآليات التي تقوم عليها البيولوجيا التطورية ودراسة علم الأمراض الأمراض التي تصيب البشر بسبب درجة كبيرة من المحافظة الجيني مع البشر. علم الوراثة الكيميائية يتطلب اجراء اختبارات مفادها أن الجزيئات الصغيرة لديها على عملية بيولوجية، وأصبحت وسيلة شعبية الأبحاث المترجمة للتعرف على المركبات العلاجية. الزرد جذابة خصيصا لاستخدامها في علم الوراثة الكيميائية بسبب قدرتها على إنتاج براثن كبيرة من أجنة شفافة، والتي يتم إخصابها خارجيا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون بسهولة الأجنة الزرد المخدرات يعامل بإضافة بسيطة من مركب إلى وسائل الإعلام الجنين. باستخدام كله يشن الموقع التهجين (WISH) في، التعبير مرنا يمكن تصور واضح داخل الأجنة الزرد. معا، وذلك باستخدام علم الوراثة الكيميائية وWISH، يصبح الزرد سياق الحي كله قوي فيها لتحديد الخلوية والفسيولوجيةآثار جزيئات صغيرة. وقد تم إحراز تقدم في التقنيات المبتكرة التي تستخدم إجراءات الفرز القائم على الجهاز، ولكن للعديد من المختبرات مثل هذه الخيارات لا يمكن الوصول إليها أو لا تزال باهظة التكاليف. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية تنفيذ شاشة عالية الإنتاجية اليدوية الكيميائية الوراثية التي تتطلب موارد الأساسية، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فريق فردي أو صغير واحد في فترة زمنية فعالة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية مجدية والتي يمكن تنفيذها من قبل مجموعات بحثية لأداء الوراثة الكيميائية في الزرد، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاكتساب الأفكار الأساسية في العمليات التنموية، وآليات المرض، والتعرف على مركبات جديدة ومسارات الإشارات التي لها تطبيقات ذات الصلة طبيا .
Introduction
تحديد العقاقير العلاجية فعالة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان هو نهاية اللعبة بالنسبة لكثير من الباحثين الطبية الحيوية. في حين أن تحديد وتوصيف وكلاء الدوائية المحتملة للتطبيقات السريرية له قيمة واضحة للرعاية الصحية، إلا انه لا يزال يشكل تحديا كبيرا. في نهاية المطاف، وتطوير العديد من المركبات العلاجية تأتي من معرفة كيفية أنواع معينة من الخلايا إما تتطور أو وظيفة. الزرد، دانيو rerio، هو مكتملة العظام المياه العذبة من عائلة شبوطيات التي أصبحت كائن النموذج السائد في البيولوجيا التطورية 1. الزرد وراثيا الفقاريات الانقياد التي هي سهلة للحفاظ على والتلاعب للدراسات العلمية 2،3. الجنين الزرد شفافة، المخصبة خارجيا، ويمكن أن تنتج من قبل مئات من زوج واحد التزاوج الكبار في أسبوع واحد فقط 2،3. وعلاوة على ذلك، حصة أجهزة الجسم الرئيسية الزرد وتمتلك د كبيرegree التشابه الجيني مع الثدييات، بما في ذلك البشر 4. لافت للنظر، و 70٪ من الجينات البشرية لها orthologue الزرد 4. ونتيجة لهذا التشابه، كانت الزرد نظام التجريبية ذات أهمية كبيرة لدراسة آليات تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء، و قد استخدمت لتلخيص العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 5-7. هذه الأسباب وغيرها، جعلت الزرد مرشحا مثاليا لمواصلة التحقيقات الوراثية ونتج عنه زيادة مطردة التقدير لفائدة الزرد في أبحاث الطب الحيوي 6،7.
على مدى العقود القليلة الماضية، وقد وضعت وفرة من الأدوات الوراثية في الزرد. الجينوم الزرد غير قابلة للالطفرات وtransgenesis 3. حتى الآن، تم تنفيذ عدد كبير من الأمام وعكس الدراسات الجينية، مما يؤدي إلى توليد أكثر من 9،000 المسوخ 3. وعلاوة على ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا لها أن تكونخلق أون، والتي مكنت من وضع العلامات وعزل أنواع معينة من الخلايا 3. فقد كانت هناك جهود كبيرة الجارية لتركيز وتوزيع هذه الموارد للمجتمع البحوث، والتي يمكن الوصول إليها عن المختبرات بتكلفة منخفضة نوعا ما من خلال المركز الدولي للاسماك الزرد الموارد (ZIRC) 8. وعلاوة على ذلك، مستودع واسعة من المعلومات البيولوجية والأدوات الجزيئية، بدءا من أنماط التعبير الجيني لmorpholino متواليات والبروتوكولات، وقد تم شرحها بشكل تدريجي على شبكة المعلومات الزرد (ZFIN) 9-11. وقد بذلت هذه البنية التحتية البحثية الزرد ممكن من خلال دعم NIH كبير والدعوة لهذا النموذج الحيواني 8. استمر هذا المخبأ من المسوخ الزرد، خطوط المعدلة وراثيا، والمعلومات ذات الصلة لتكون ذات قيمة استثنائية للمجتمع الأبحاث البيولوجية ككل. ومع ذلك، في حين الزرد الآن نموذج كائن راسخة والبارز، فإنها لا تمثلrgely غير مستغل لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض من خلال استخدام شاشات الوراثية الكيميائية.
علم الوراثة الكيميائية هي استخدام الجزيئات الصغيرة، مثل المخدرات أو غيرها من المركبات، أن تؤثر عملية بيولوجية ضمن نظام المعيشة 12. يمكن تطبيق علم الوراثة الكيميائية لفهم الآليات الجزيئية وظيفة الجين، مثل التعرف على العوامل التي الإنقاذ أو تفاقم خلل جيني معين 12. وعلاوة على ذلك، وعلم الوراثة الكيميائية تمثل سبيلا رئيسيا واحدا لإجراء البحوث متعدية 12. بينما كانت شاشات الوراثية التقليدية إلى الأمام في النماذج الحيوانية قوية جدا في ربط جينات معينة للأمراض، فهي تفتقر إلى البعد الزماني، مما يجعل من الصعب أو من المستحيل أحيانا لمراقبة الظواهر التي قد تنشأ بعد مرحلة التطور الجنيني المبكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التكرار الجيني يجعل النتائج لوحظ من علم الوراثة إلى الأمام يصعب تفسيرها. بدلا من ذلك، وشاشات جينية الكيميائيةالسماح للسيطرة الزمنية الدقيقة وتوفير وقت واحد نقطة انطلاق قيمة لاكتشاف المخدرات 12،13.
علم الوراثة الكيميائية يمكن أن يؤديها في استخدام أنظمة الأنابيب (مثل خطوط الخلايا والبروتينات) أو باستخدام نظام في الجسم الحي، مثل الحي كله. يمكن استخدام النظام في المختبر لعلم الوراثة الكيميائية يكون مفيدا لأنه أبسط من نظام الحي كله، وأسهل للعمل مع على نطاق واسع، أقل تكلفة، وأقل استهلاكا للوقت. ونتيجة لذلك، في المختبر أنظمة تسمح لكلا الإنتاجية العالية الفرز (HTS) وفحص عالية المحتوى (HCS). هناك عدد من المزايا لاستخدام نظام في المختبر التي يجب أخذها في الاعتبار عند الاقتراب الوراثة الكيميائية، ولكن أيضا قيود كبيرة. أحد أوجه القصور الرئيسية لاستخدام خط الخلية هو أن جزيئات صغيرة يمكن أن يكون فعال وغير سامة في خط خلية معينة، ولكن عندما تصبح سامة أدخلت في الحي كله. وبالتالي، فإن جوهرالقضية هي أن في المختبر أنظمة لا تعبر عن السياق العام للكائن الحي، وبالتالي ليست قادرة على تقليد بدقة ما يحدث في الحي كله دائما. في حين أن الاختبار المركب في الكائنات كلها يمكن الالتفاف على هذه القضايا، واستخدام الثدييات نماذج الحي كله يطرح عددا من القيود المادية والأخلاقية. على سبيل المثال، فحص المخدرات في الماوس وأعاقت وجستيا من الفضاء والنفقات اللازمة لاختبار حجم العينة المناسب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب الأسئلة التنموية للدراسة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن تطور الثدييات في الرحم. أخيرا، في حين أن إجراء البحوث الطبية الحيوية له قيمة اجتماعية كبيرة، ومع ذلك هناك احتياجات كبيرة لحماية الرفق بالحيوان عن طريق الحد من دراسات مكثفة وتخفيف الألم والمعاناة من الحيوانات المستخدمة في الأبحاث. الزرد توفر بديلا صالحا للعمل مع الفقاريات العليا مثل الثدييات، وعلاوة على ذلك، العديد من المواضيع يمكن دراستها باستخدام علم الوراثة الكيميائية فيالمراحل الجنينية واليرقات عند معالجة العصبية غائب أو المنطوق عند مستوى منخفض 12،13.
حتى الآن، تم إجراء عدد لا يحصى من شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الأجنة الزرد على وجه الخصوص، وتسليم المجمع يمكن تحقيق ذلك عن طريق غمر الأجنة في وسائل الإعلام التي تحتوي على المخدرات من اهتمام 12-15. وعلاوة على ذلك، كانت هناك العديد من التطورات العلمية والتكنولوجية لجعل شاشات الوراثية الكيميائية ممكن ويمكن التحكم 16-20. وكان بيترسون وزملاؤه أول من استخدم الزرد في شاشة الوراثية الكيميائية في عام 2000، وفيما بعد في عام 2004 حددت مجمع أن قمعت طفرة تضيق الأبهر في الزرد 21،22. ومنذ ذلك الحين نفذت شاشات الكيميائية لدراسة عدة أنسجة نامية (مثل القلب والدم والأوعية) 23-25، الوظائف الفسيولوجية (على سبيل المثال، أساس العصبية للسلوك) 26، 27،28 تجديد الكبار، وامراض النماذج الإلكترونية (مثل ضمور العضلات والسرطان) 29،30. من بين هذه الشاشات الكيميائية الزرد، اتخذت اكتشاف البروستاجلاندين التي تنظم الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى التجارب السريرية على البشر، مما يدل على القدرة على الانتقال من "دبابات إلى السرير" 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500. NCT01627314). وفي الآونة الأخيرة، ظهرت علاجات واعدة المرشح لأجهزة معقدة مثل الكلى وعلاجها علم الأمراض الخلوي الذي في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34 و قصور كلوي حاد 27،35، على الرغم من أن هذه لديها حتى الآن للانتقال إلى التجارب السريرية. تظهر هذه الشاشات الوراثية الكيميائية على نطاق واسع فائدة اختبار المركبات الصغيرة في الزرد النامية والقدرة على تطبيق علم الوراثة الكيميائية لاستجواب وظيفة الأنسجة الكبار. وعلاوة على ذلك، هناك قائمة متزايدة من مجموعات الأدوية المتاحة تجاريا التي تكون متاحة للدراسات الأكاديمية 19.
ove_content "> وفي السنوات القليلة الماضية، كانت هناك تطورات بارزة في مجال تكنولوجيا الفحص الجيني الكيميائية، بما في ذلك استخدام النظم الآلية الروبوتات الاستغناء عن المخدرات والتعامل معها، جنبا إلى جنب مع أنظمة التصوير الآلي 36-38. هذه النظم تسمح بإمكانية اختبار عدة آلاف من المركبات على حد سواء لتحقيق HTS وHCS 36-38. وللأسف، فإن التعهد شاشات الوراثية الكيميائية مع هذه المؤسسات الروبوتية مبتكرة تتطلب عادة موارد كبيرة. هذه الأنواع من الموارد تشكل عائقا كبيرا للعديد من المؤسسات التي تفتقر إلى رؤوس الأموال للحصول على وتشغيل وصيانة هذه الأجهزة. ورغم تأسيس البنية التحتية للمعالجة الآلية للمكتبات الكيميائية، بما في ذلك نقل الأجنة إلى المحتشدة لوحات، لا تزال باهظة بالنسبة لكثير من المختبرات والتصوير الآلي وتحليل التكاليف عموما أكثر يمكن الوصول إليها 12. تمكن الآلي فحص الصورة الكمي من الفلورسنت إعادة المعدلة وراثياالحمالين ويسهل تحليل المظهري محدد 12،15.على الرغم من أن النظم الآلية تمثل التقدم التكنولوجي مفيدة، أسئلة كثيرة يمكن معالجتها من خلال شاشات اليدوي أكثر تركيزا، مثل الاستعلام من عدة آلاف من المركبات النشطة بيولوجيا في العملية التنموية مع كامل جبل الموقع التهجين (WISH) قراءات في 39. وعلاوة على ذلك، في حين أن عددا متزايدا من مختبرات والتذرع شاشات الكيميائية الزرد للتحقيق في مسألة بحثية، وعدد قليل التشبع (إن وجدت) وصلت الجهود والعديد من المواضيع حتى الآن لم يتم اختراقها باستخدام علم الوراثة الكيميائية. يمكن تنفيذها باستخدام شاشات الكيميائية الزرد مستعمرة صغيرة تتألف من عدد قليل فقط من النوع البري أو الدبابات المعدلة وراثيا. لذا، ينبغي أن يكون هذا الشكل من الاستجواب الجيني يمكن بلوغه من قبل معظم المجموعات البحثية الزرد المهتمة في توسيع / تنويع في هذه الساحة. المكتبات الكيميائية متفاوتة الحجم يمكن شراؤها من الموزع التجاري و / أو عمودlaborators. لهذه الأسباب، يمكن أن الوراثة الكيميائية يكون مجديا اقتصاديا حتى في المناخات القاسية التمويل. ومع ذلك، هناك عقبات في بداية شاشة الوراثة الكيميائية، مثل كيفية تخطيط الجوانب اللوجستية للشاشة: على سبيل المثال، فإن عدد الموظفين اللازمين لشاشة ناجحة، وتخصيص وقت مخصص والتفكيك معا بروتوكول المادي لعينات العملية يدويا هذا العدد من بضع مئات إلى عدة آلاف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الجنين الزرد مع WISH بمثابة قراءة المغادرة. يتضمن هذا الأسلوب العلاج من تعاطي المخدرات من الأجنة الزرد، تليها الكشف riboprobe النصوص مرنا. باستخدام هذا البروتوكول، فريق صغير أو حتى فرد واحد يمكن فحص وتحليل معقول مكتبة الكيميائية متواضعة حوالي 600 مركبات في غضون 9 أسابيع.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن الوراثة الكيميائية في الزرد أن يكون لها تأثير حاسم على تطور اكتشاف المخدرات. يوفر هذا البروتوكول طريقة الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الأجنة الزرد مع رغبة للقراءة خارج، مما يتيح لفريق فردي أو صغير فعال لإجراء شاشة جزيء صغير. هذه الطريقة الحد الأدنى من الموارد يمتد جدوى الوراثة الكيميائية إلى العديد من المجموعات البحثية. على وجه التحديد، توفر هذه الاستراتيجية الشاشة بديلا مهما لاستخدام الأجهزة الروبوتية، وهذه الأنظمة لا يمكن الوصول إليها عبر إدارات البحوث على نطاق واسع. تتيح هذه الشاشة اليدوية فرد واحد لاختبار واحد 96 لوحة جيدا من المركبات مع قراءات WISH في أسبوع العمل 6 أيام. منذ الزرد على بياض، مع الأجنة النامية خارج الأم والأجنة هي كبيرة بما يكفي لرؤية بالعين المجردة (بين 1-3 ملم)، فهي قابلة للمعالجة اليدوية مع أدوات بسيطة ويمكن للباحث في عينات مجموعةلوحات متعددة جيدا من دون استخدام المجهر. وعلاوة على ذلك، منذ الزرد تتطور بسرعة، ويمكن التعرض جزيء صغير يكون فعالا مع علاج واحد من مركب، بدلا من الجرعات المتكررة، مما يقلل مزيد من المعالجة اليدوية. الأجنة الزرد وتربيتها بسهولة لأن صفار البيض يوفر لهم مصدرا للتغذية يصل إلى 5-6 أيام بعد الإخصاب، مما يلغي مضاعفات تغذية اليرقات. بالإضافة إلى ذلك، فإن غالبية أجهزة اليرقات تطورت وأصبحت وظيفية خلال هذه الفترة، والتي توفر الفرصة لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. إضافة بسيطة من الجزيئات الصغيرة إلى وسائل الإعلام الجنين الحضانة غير الغازية ويسمح للباحث (ق) لتحديد للجرعة الدواء، وقت بالإضافة إلى ذلك، ومدته توفير رقابة مشددة على العديد من المتغيرات والسماح لعمليات تنموية محددة، وبالتالي التعرض لل من مصلحة ليتم الاستعلام عنها. كما هو موضح هنا، لا يمكن تحقيق إنتاجية البحثية الهامة في timefr قصيرةAME باستخدام هذه المنهجية شاشة اليدوية. في تجربتنا، وهناك ارتفاع العائد على الجهود المستثمرة، والتي يمكن بفعل باستخدام مكتبة الكيميائية النشطة بيولوجيا معروفا لتحليل عملية من الفائدة، مثل تجزئة كليون خلال تطوير الكلوية (الشكل 4؛ Poureetezadi وWingert، غير منشورة).
الشاشة الكيميائية يدوية الموصوفة هنا هي متعددة للغاية لأنه ينطوي على فحص على عينات الزرد الثابتة. على سبيل المثال، يمكن مراجعة هذه الاستراتيجية لاختبار عدة لوحات المركبات في أسبوع واحد ومن ثم ليسجل الأجنة في الأسبوع التالي. فحوصات على عينات الزرد بديلة ثابتة، مثل المناعية أو غيرها من تلطيخ الأنسجة الاستعدادات، ويمكن أيضا أن تكون بديلا للWISH قراءة المغادرة. استراتيجيات تجريبية لأداء المقايسات الخلوية في الزرد قابلة للتكيف بسبب وضوح بصري والشفافية من مراحل النمو المبكرة. وعلاوة على ذلك، يمكن للباحثين تمنع تصبغ في وقت لاحق ستاغيس استخدام المواد الكيميائية أو تجنب المضاعفات التنمية الصباغ تماما من خلال استخدام خطوط الجينية الصباغ أقل مثل كاسبر أو الزرد الكبير 13. فمن الممكن لإدارة الجزيئات الصغيرة يدويا، معالجة وصمة عار (ق) من الفائدة، ويسجل أجنة باستخدام stereomicroscope بسيط يدويا. ومع ذلك، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن تحليل الصور آليا يمكن أن يؤديها، وربما في الواقع هناك حاجة لتحليل النمط الظاهري عالية الدقة. على سبيل المثال، قد يكون من الأفضل لشريك نظام تحليل الصور آليا مع الفحص المباشر، مثل مراسل المعدلة وراثيا، وهذا يبسط المعالجة اليدوية من العينات، تقيس الاختلافات لا يمكن تمييزها بسهولة بالعين المجردة، ويزيل الباحث التحيز 15. لحسن الحظ، بعض أنظمة التصوير الآلي على حد سواء واقتصادية من حيث تكاليف برنامج 15 سهل الاستعمال. استخدام وقدرات الأنظمة الآلية الأخرى تطورت ويمكن بسرعةأن تستخدم لتوجيه الكائنات الحية، وإدارة العلاج بالعقاقير، وحتى للانتقال الكائنات 12،15. وقد بشرت هذه النظم الآلية في العصر التكنولوجي الجديد من الأبحاث وقدمت حلولا مبتكرة لمعالجة كميات كبيرة من مواد الاختبار، وبالتالي أداء HTS والنهج HCS في الكائنات كلها 12،15. في حين أن مثل هذه الآلات هي أدوات مفيدة بلا شك، بل هي أيضا مكلفة جدا وبعيدا عن متناول العديد من مختبرات الأبحاث الأساسية. دون الوصول إلى هذه القدرات الآلي قد يبدو أن شاشات الكيميائية ليست ممكنة. ومع ذلك، يوضح هذا البروتوكول دليلا لكيفية إجراء شاشة اليدوية التي يمكن استخدامها لإكمال الشاشة الوراثة الكيميائية بطريقة عملية على مدى فترة معقولة من الزمن.
السلبيات لكلا الفرز اليدوي والكيميائية علم الوراثة بشكل عام موجودة، ويجب أن يوضع في الاعتبار عند النظر في الشاشة الكيميائية. على وجه الخصوص، الأسلوب هو موضح هنا يتطلب درجة معتدلةمن البراعة الجسدية. هذا القلق هو تقلص أو ينفي تماما من خلال التكرار، والبراعة سوف تتحسن مع الممارسة. بالإضافة إلى ذلك، هناك مجالا الحد الأدنى للخطأ جسيما، كما أن هناك 10٪ فقط الأجنة جيدا للتحليل. يمكن للجزيئات صغيرة تختلف في انتفاذ من النمط الظاهري التي يسببها، وذلك على التهديف نظام معقول لتحديد المركبات ذات الاهتمام يجب الالتزام بها. فمن الأهمية بمكان أن الباحثين باستخدام هذا البروتوكول تضع معايير صارمة مناسبة لما سوف تنظر ضرب. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن طبيعة هذا النوع من الشاشة من المرجح أن تسفر عن جزء معين من ايجابيات كاذبة، والتي يمكن أن يرسم من خلال مزيد من العمل الكيميائي المتابعة. وعلاوة على ذلك، فمن الأهمية بمكان لتنظيم الأجنة بدقة وجمع براثن للفحص بعد فترة وجيزة من الإخصاب، والتنمية غير متزامن يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات في تقييم دقيق لأثر العلاج بالعقاقير. وعلاوة على ذلك، في ما يخص الفحص الكيميائي، بحكماستراتيجية perimental، هناك مجموعة من القيود. الذوبان مركب وسمية جزيئات الناقل (على سبيل المثال، سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)) ويمكن أيضا تقديم قضية وذلك قد تكون باهظة في اختبار العديد من الجزيئات. يمكن المشيماء أيضا بمثابة حاجز التعرض المخدرات. أخيرا، على الرغم من الزرد هي نموذج قوي ومتعدية لعلم الوراثة الكيميائية، ينبغي دائما توخي الحذر في تحديد ما إذا كانت استراتيجية بديلة شاشة الكيميائية، على سبيل المثال، باستخدام نظام في المختبر مثل خط خلية، يمكن أن تكون بديلا لاستعمال العموم الحيوانات. ومع ذلك، يعتبر العلاج الكيميائي في النظام الزرد كله أفضل من إجراء مقاربات مماثلة في الثدييات، حيث أنه يوفر ميزة جمع الآثار النظامية للمركبات، ويمكن تمكين الباحثين من فرز قائمة المركبات التي سيتم اختبارها في نموذج الثدييات.
حتى الآن، وقد وفرت شاشات الكيميائية الزرد قوية التجريبي أداة رس تحدد آليات تطوير والتأكد كلاء الدوائية مرشح لاستخدامها في الطب، مثل تحديد الجزيئات قادرة على منع أمراض الأمراض. على سبيل المثال، دراسة أجراها بيرنز وزملاؤه بتطوير الفحص الدقيقة جيدا الآلي لمعدل ضربات القلب باستخدام الأجنة الزرد المعدلة وراثيا التي أعربت عن GFP في عضلة القلب 42. استخدموا هذا الخط المعدلة وراثيا لتحليل معدل ضربات القلب في التنمية وكيف تأثر ذلك على العلاج من تعاطي المخدرات 42. دراسة أخرى، عن طريق اختبار الكثافة السكانية من الخلايا الجذعية المكونة للدم في الجنين الزرد، حدد البروستاغلاندين E2 أن ينظم مكانة شهادة الثانوية العامة 23. تم التحقق من صحة هذه النتيجة في الماوس، ونفذت في وقت لاحق لإجراء تجارب سريرية في زرع الحبل السري الإنسان 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500، NCT01627314). ، وقد ثبت من خلال العديد من الدراسات التي أجريت مؤخرا الوراثة الكيميائية أن تكون مفيدة في دراسة أمراض الكلى باستخدام الزرد <sتصل> 43. يوفر الكلى الزرد لنموذج ممتاز لدراسة تكون الكلية أو تجديد كليون، الوحدة الوظيفية التي تتكون من الكلى خلال تطوير والكلى الحاد إصابة 43. يتم حفظها للغاية هيكل كليون بين الكلى الزرد الجنينية والكبار الكلى الثدييات 44-50. العديد من الدراسات فحص الكلى الجنينية الزرد تبين بوضوح إمكاناتها الكامنة متعدية عندما يقترن الوراثة الكيميائية. وأجريت شاشة الوراثة الكيميائية على اثنين من المسوخ الزرد التي تم تعيينها إلى pkd2 الجينات وift172، والتي من المعروف أن اللاعبين الرئيسيين في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34. أسفرت الشاشة في تحديد deacetylase هيستون عموم (HDAC) المانع trichostatin ألف (TSA) كما جزيء صغير يمكن أن تبطل العيوب الشكلية ينظر عادة في الأجنة متحولة. وهناك نهج مختلف اتخذتها دي GROH وزملاؤه لفحص المركبات التي inducإد ذمة في البرية من نوع الأجنة الزرد، التي من شأنها أن تشير إلى وجود اختلال في وظائف الكلى 35. بعد تحديد PTBA كما ضرب، لاحظوا أنه بالإضافة إلى التسبب في ذمة، وأيضا زيادة PTBA التعبير عن pax2a، علامة لالأسلاف الكلوي. الأهم من ذلك، ثم أظهرت مشتق من PTBA الأمثل لتقليل الوفيات في المئة من البالغين الزرد التي خضعت الناجم عن جنتاميسين تلف الكلى وعلاوة على ذلك، تسارع تعافي الفئران التي عانت من التلف الكلوي 27. أخذت معا، وهذه المساهمات من الزرد الوراثة الكيميائية تسليط الضوء على أنواع الاكتشافات التي يمكن إجراؤها باستخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول.
في حين أبحاث الوراثة الكيميائية يحمل ميزة كبيرة، فإنه لا يخلو من بعض التحديات. فقط باستخدام نهج الوراثة الكيميائية يمكن جعلها معقدة لتحديد الجين أو الجينات المحددة التي يجري المتضررين من المجمع. حتى لو تم العثور على الهدف (ق)، والاشتراكيةيمكن أن تبقى الفجوة بين gnificant تحديد مركب وفهم آلية (ق) من العمل في أي جزيء صغير يتصرف. على سبيل المثال، يمكن أن يكون من الصعب تحديد الآلية التي جزيء صغير يتصرف لأنه مركب واحد قادر على وجود مجموعة من الآثار المختلفة داخل الكائن الحي. ومع ذلك، مع ظهور التكنولوجيا الحديثة وشاشات جينية المزيد الكيميائية التي يجري الانتهاء منها في الزرد، ومشكلة تحديد آلية آخذة في التقلص. طريقة واحدة للمساعدة في تحديد الآثار الجزيئية للمركبات التي تم تحديدها هو اختيار مكتبة المخدرات من bioactives المعروف للفحص، حيث يحتمل أن تكون آليات يمكن استنتاجها من البيانات المشروح سابقا. بالإضافة إلى ذلك، خوارزميات chemoinformatic، مثل بوابة ديسكفري، متاحة للاستخدام التي يمكن مقارنتها التشابه الهيكلية للمجمع مقابل قاعدة بيانات للمركبات مع آليات أرجع 14. طريقة أخرى لتوضيح آلية عمل مركب سيكون لتوليد ميكرoarray البيانات الشخصية بعد معالجتها ومن ثم الاستعلام هذا الملف في تجميع ملامح المخدرات ميكروأري، مثل الربط خريطة، والبحث عن مركبات محددة ميكانيكيا التي تثير تأثير مماثل 14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لتحديد الطفرات الوراثية التي لها تأثير مماثل لمجمع الفائدة. إيجاد علاقة بين مركب والمسخ قد تشير إلى أن المجمع يعمل جزيئيا المنبع أو المصب من الجينات ذات الصلة، والتي يمكن أن يرسم من خلال معالجة المسوخ مع المجمع وmorpholinos. وثمة خيار آخر يكون مطياف الكتلة، والتي تستمر لتصبح أكثر الأمثل لالزرد. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحديد التغييرات البروتين محددة أو تعديلات ما بعد متعدية بعد العلاج من تعاطي المخدرات. أخيرا، جزيئات صغيرة أو حتى مكتبات بكاملها قادرة في بعض الأحيان من أن المعلمة لالمنسدلة من الشركاء ملزم. ومن الجدير بالذكر أيضا، أنه في حين أن آلية لكيفية وظائف جزيء صغير طS الاستيراد كبيرا، وهناك المخدرات وافقت عليها الهيئة للآليات التي لا تزال مجهولة.
على الرغم من الزرد يحمل العديد من أوجه التشابه مع كل من الثدييات وراثيا وفسيولوجيا، لا تزال هناك قضية عبور المخدرات 14. التحقيق في واحدة دراسة القدرة كروس من الزيارات من الشاشة لمثبطات دورة الخلية في الأجنة الزرد 50. أسفرت الشاشة في تحديد 14 الزيارات التي لم تكن معروفة سابقا لامتلاك النشاط دورة الخلية. للخروج من هذه المركبات 14، تم العثور على 6 لخلية نشاط دورة في كل تجارب زراعة الخلية البشرية والزرد، وعرضت 3 أن يكون المعطل مصل في تجارب زراعة الخلية (1)، كان نشطا فقط في الخلايا الزرد، و 4 لديه أي نشاط في أي الزرد أو تجارب زراعة الخلية البشرية، ولكن فقط في الكائن الحي كله الزرد. والجدير بالذكر أن المركبات التي لديها 4 النشاط إلا في الزرد تبين أن هناك اختلافات بين الزرد والثدييات التي قد prohiبت إمكانية متعدية لبعض المركبات. وهذا اعتبار هام لأن تضع في اعتبارها، ولكن هناك أمثلة من الجزيئات الصغيرة، مثل PGE 2 مما يزيد من قدرة HSCs إلى تدبر في المتلقين البشري وPTBA-المشتقات التي تعمل على تحسين معدل الشفاء الكلوي في الثدييات، وبالتالي توفير الدليل من مبدأ أن كروس ممكن 23،31-33.
بغض النظر عن هذه المزالق، وعلم الوراثة الكيميائية وهذا نهج الحد الأدنى من الموارد لديها الكثير لتقدمه للمجتمع البحث. علم الوراثة الكيميائية هي مفيدة بشكل خاص في الزرد، وسوف تستمر في لعب دور حاسم في مسار التحقيق الجزيئية واكتشاف المخدرات. وكانت شاشات الكيميائية على أساس أهداف جزيئية منفصلة تاريخيا تخضع لنسبة الفشل مرتفعة بسبب ما يعرف كوكبة من الامتزاز والتوزيع والتمثيل الغذائي، وإفراز، والسمية (ADMET) الخصائص 51. شاشات الكيميائية التي تستخدم الزرد لالتركيز على العملية، وليس هدفا منفصلة، يمكن التحايل على العديد من المشاكل ADMET وتحديد المركبات التي تكون فعالة في سياق الكائن الحي بأكمله. مع مجموعة متزايدة من الموارد المتاحة للبحث الزرد، بما في ذلك سلالات متحولة الحالية والقدرة على استخدام الجينوم التحرير لخلق طفرات الجينات الوراثية وهادفة، هناك تقريبا عدد غير محدود من شاشات الوراثية الكيميائية المحتملة باستخدام الزرد. تم إقامته العديد من المكتبات الكيميائية، ومجموعات تمتد مع bioactives معروف، مركبات جديدة ومتنوعة هيكليا وبنيويا مماثلة. توفر هذه الكواشف ثروة من الفرص المثيرة للمجموعات الشاشة المتوفرة حاليا، ومن المرجح أن يزداد في السنوات القادمة. مع هذه الاحتمالات في متناول اليد، ويوفر هذا البروتوكول اليدوية والإنتاجية العالية بطريقة عملية وسهلة الاستخدام لزيادة قدرة المجموعات البحثية لإجراء شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الزرد.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال تمويل للمختبر أبحاث Wingert مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر بول كروجر T. الابن لتوفير التغذية المرتدة حاسم على المخطوطة. نشكر موظفي قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء من الباحثين و لدينامختبر الفصل على تعليقاتهم والمناقشات والأفكار حول هذا العمل.
Materials
| JoVE 51922 MATERIALS | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
| 1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
| 10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
| block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
| MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
Referenzen
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
