레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭,<em> Tribolium castaneum</em

1 T. castaneum 주식 및 배양 T. 결정 castaneum 변형 실험을 위해 사용합니다. 참고 : 여러 실험실 설립 T. castaneum 균주를 사용할 수 있습니다. 조지아-1 (조지아-1) 게놈 염기 서열 3에 사용 된 가인이의 부모의 변형이다. 조지아-1 (예 : 단일 염기 다형성 등, SNP를) 공유 대부분의 DNA 다형성을 조지아-2와 인해 적은 근친 교배에 가인이보다 건강이기 때문에, RNAi의 실험에 적합하다. 푸 (11)가 사용하는 또 다른 편리한 변형입니다 미래 날개 primordia의 고유 한 강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP) 식을 다른 령충에서 마지막 애벌레 령을 구별 할 수있게 해준다으로, (클라크 Hachtel 등. 2,013 12의 그림 S4 참조). 유전 적 배경이 크게 AFF에 나타나는 그것은 실험에 사용 된 딱정벌레 변형 문서화하는 것이 중요하다요법의 RNAi는 13 표현형. T. 준비 (혼합 후, -20 ° C에서 문화 밀가루를 저장) 유기농 통밀 가루에 미리 체질 맥주의 효모의 (중량) 5 %를 추가하여 castaneum 문화 밀가루. 6온스 플라스틱 초파리 스톡 병 (약 40g / 병)에 (실온에서) 문화 밀가루를 나누어지는. 문화 T. 70 %의 습도가 30 ° C에서 castaneum. 습도 제어 인큐베이터 가능한 경우 사용합니다. 문화 병 당 30 ~ 40 성인 추가 (남성 : 여성 비율 1 : 1) 문화를 시작합니다. 참고 : 곰팡이가 거의 문화 밀가루에 곰팡이가 발생할 수 있습니다 30 ° C 70 % 습도, 낮은 온도 (예 : 25 ° C에서)에서 문제가되지 않지만. 이 경우 습도를 낮 춥니 다. 계대 배양 (문화 가루 성인을 분리하는 방법에 대한 단계 5.2-5.5 참조) 모든 이주 새로운 문화 병으로 성인을 전송합니다. 참고 : 마지막 령 유충을 얻기 위해 약 3 주 정도 소요됩니다. Alternatively, T. castaneum 문화가 더 이상 배양 기간 임에도 불구하고, 낮은 온도 (20 ~ 25 ° C에서)에서 유지 될 수있다 (25 ° C에서 개발 시간은 약 두 배에 30 ° C에서)입니다. 애벌레 dsRNA를 주입하기위한 솔루션 및 인스트루먼트의 2 준비 시험 관내 전사에 의해 표적 유전자 상동의 dsRNA 분자를 합성한다. -80 ° C에서 보관하십시오. 자세한 분자 생물학 절차 필립과 Tomoyasu 2011 11를 참조하십시오. 또한의 dsRNA 분자를 설계 할 때 고려해야 할 파라미터 번호 논의 참조. 1.5 ml의 1 M의 NaH 2 PO 4 8.5 ml의 1 M 나 2 HPO 4를 혼합하여 (25 ° C에서의 pH 7.6) 0.1 M 인산 나트륨 완충액을 확인합니다. pH 미터로 pH를 확인하고 그에 따라 조정합니다. 100 _, (25 ° C에서의 pH 7.6), 0.1 M 인산 나트륨 완충액 10 ㎕를 혼합하여 10 배 주사 완충액 1 ㎖를 확인6; 리터 0.5 M의 KCl, 녹색 식품 염료 100 ㎕ 두 번 증류수 790 μL (DDH 2 O). 배 주입 버퍼 (200 ㎕의 10 배 주입 버퍼 + 800 ㎕의 DDH 2 O)를 만들기 위해 10 배 주입 버퍼를 희석. 필요할 때까지 4 ° C에서 모두 10 배 및 2 배 주입 버퍼를 저장합니다. 스티커 유리 슬라이드를 준비합니다. 애벌레 주사제 다 repositionable 접착제의 형태와 전체 유리 슬라이드를 커버. 성인 또는 번데기 주사제, 슬라이드의 긴 모서리를 따라 접착제이 얇은 스트립을 확보. 또한 주사 후 자신의 제거를 용이하게하기에 충분 휘기 쉬운 유지하면서 접착제, 접착제 슬라이드에 딱정벌레를 준수 할만큼 볼품 유지되도록 몇 일 동안 건조시킵니다. 참고 : 접착제가 너​​무 끈적 유지하는 경우, 손가락을 사용하여 점착성을 줄일 수있는 접착제를 누릅니다. 각 슬라이드는 40 또는 50 딱정벌레까지 수용 할 수 있으며 안전하게 동물을 잡아 실패 할 때까지 재사용 할 수 있습니다. Altern테이프가 때때로 유충을 저장하기에 충분히 접착되지 않는다 atively, 양면 테이프도 사용할 수있다. 에테르 마취 바구니를 확인합니다. 10 ㎖의 일회용 주사기에서 플런저를 제거하고 6 ml의 라​​인 주위에 반으로 주사기를 잘라. 주사기의 하단을 폐기하십시오. 간단히 가스 버너와 주사기의 상단 부분의 절단면을 가열하고 신속 주사기 위에 메쉬를 붙 나일론 메쉬 편 상에 용융 수지를 밀어. 플라스틱은 견고하게되면 초과 메쉬를 멀리 낸다. 에테르 병을 준비합니다. 좁은 입 100 또는 250 ㎖의 유리 병에 에테르 30 ML을 추가합니다. 에테르의 증발을 향상시키기 위해 휴지 여러 조각을 추가한다. 참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 항상 흄 후드 에테르을 처리합니다. 사용 긴밀하지 동안 뚜껑을 닫습니다. 참고 : 얼음은 sedatio 있지만 (예 : 교실 환경에서와 같이) 안전한 대안으로 사용할 수 있습니다여기서 n은 덜 효과​​적이다. 유생의 사출 장치의 제조 3 해부 현미경에 XY 기계 무대를 놓습니다. 참고 : XY 기계 단계 주요 현미경 회사에서 사용할 수 있습니다. 대안 적으로, 저렴 현미경 스테이지는 또한 일부 수정 대부분 해부 현미경에 사용될 수있다 (예를 들면 재료 표 참조). XY 메카니컬 스테이지 근처에있는 기계 바늘 매니퓰레이터를 놓습니다. 주입 주사기를 조립합니다. 주사 바늘의 압력에 영향을주지 않고 주입 주사기의 조작을 허용하는, 유리 바늘 홀더에 30 ml의 일회용 주사기를 연결하는 (루어 형 연결부)와 사 방향 스톱 콕을 사용하여 (자세한 주입 주사기 필립 Tomoyasu 2011 11 참조 조립). (4) 당기 주입 바늘 에 의해 붕규산 유리 바늘 (0.5 mm, 15cm 길이 : 1mm, ID B100-50-15, OD)를 당겨바늘을 끌어 당기는. 참고 : 셔터 P-87이나 P-97은, 설정 사용을 위해 "열 = 70 = 45, VEL = 75 시간 = 90을 당겨"또는 피펫 요리 책의 제 2 장을 따르 자기편 셀, C를 엘레 간스, 초파리, 제브라 피쉬 &가 – 프로그램을 추천합니다. 최적의 설정은 바늘 풀러의 모델에 따라 다릅니다. 일반 초파리 주사 바늘에 대한 설정은 좋은 출발점이다. 스토어는 플라스틱 케이스 (예를 들면, 플라스틱 CD 케이스)에 바늘을 뽑아 이동식 장착 퍼티 고정합니다. (5) 분리 및 유충의 선택 체 수신기에 # 25 체를 놓습니다. 체의 문화 병 (딱정벌레와 문화 밀가루)의 내용을 놓고 즉시 내용을 선별. 유충 신속하게 체를 파고와 박히하려고합니다으로 선별하지 않고 자체에 대한 내용을 보관하지 마십시오. 적극적 밀가루 가을 수 있도록 내용을 선별를 통해 세 애벌레를 떠나 (일반적으로 여섯 번째와 일곱 번째 령 유충), 체의 상단에 뒤 (자신의 캐스트 오프 손톱, exuviae과 함께) 번데기 및 성인. 시드 팬에 체 (딱정벌레와 exuviae)에 남아있는 자료를 전송합니다. 탈출 딱정벌레를 방지하기 위해 팬을 눌러 보관하십시오. exuviae 부드럽게 시드 팬을 통해 불어 딱정벌레의 표면에 남아있는 밀가루 입자를 제거합니다. 팬의 바닥에 내용을 이동 시드 팬을 누릅니다. 그런 다음 몇 초 동안 미개발 팬을 둡니다. 더미에서 나올 다른 단계보다 더 많은 모바일 아르 성인 기다립니다. 미술 붓 (예를 들어, 1cm 폭)을 사용하여 성인을 제거합니다. 번데기로, 약간 아래쪽 팬의 입 유지하면서 부드럽게 시드 팬 노크하여 별도 번데기 빠르게 입 향해 굴러 경향이있다. 시드 팬에서만 애벌레를 떠나, 번데기를 제거하기 위해 붓을 사용합니다. 경기 수깨끗한 페트리 접시에 고립 된 유충 에이스. 주사 유충의 적절한 단계를 선택하고 별도의 페트리 접시에 배치합니다. 참고 : 성인 형태학에뿐만 아니라 변태에 RNAi의 효과를 분석 할 때 초기 마지막 령 유충 (최종 애벌레 탈피 후 1~2일)는 종종 적합하다. 그것은, 그러나, 때때로 필요 (예를 들면, 3E-3H 피규어. 또한 클라크 Hachtel 등. 2,013 12 참조) 초기 유전자 기능을 평가하기 위해 끝에서 두 번째에 (또는 이전) 단계의 RNAi을 수행 할 수있다. 유충의 령을 식별 할 크기 기준으로 번데기를 사용합니다. 마지막 령 유충은 약간 더 번데기보다. 다르게는, PU-11은 최종 령 유충을 식별 할뿐만 아니라 최근 령 유충의 개발 (클라크 Hachtel 그림 S4 외. 2,013 12)의 시간 코스를 결정하는데 사용될 수있다. 에테르 마취까지 페트리 접시에 선택한 유충을 유지합니다. 나머지를 배치다시 밀가루와 문화를 병에 넣고 인큐베이터에 반환 유충 (예 : 번데기 및 성인과) 딱정벌레의 다른 단계. 주사 바늘의 6 준비 스티커 압정 또는 양면 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드 상에 미리 뽑아 유리 바늘을 놓는다. 여기서 팁 굽힘을 볼 수있는 해부 현미경을 통해 보는 동안 집게를 사용하여 바늘의 당겨 끝을 테스트합니다. 집게와 트위스트와 함께 바늘 굴곡이 분할하는 위치의 끝쪽으로 약간 영역을 잡아. 좋은 바늘을 유지하고 다른 사람을 버린다. 그가 너무 크지도 너무 작지 여는 것으로 좋은 바늘을 고려 (약 0.05 mm 직경. 1A 및도 1B), 및 유생 표피 쉽다 (도 1b 및도 2A-2B)의 침투를 만드는 각도된다. diffi 바늘로 dsRNA를 용액의 흡수를 만드는 등의 나쁜 바늘 (I)가 너무 작은 고려컬트 (7 단계) (그림 1D 및 2D), (II) 너무 큰, 사출에 애벌레 부상하고 가능한 치사율의 원인 (그림 1C 및 2 층), 표피 어렵고 증가 부상 (III) 무딘, 제작 침투. 니들 홀더에 바늘을 삽입합니다. 먼저, 바늘 홀더의 선단부의 나사 팁 홀더에 바늘의 후방 단부를 배치. 그리고, 홀더 선단에서 (유리 바늘의 후방 단부로부터 적어도 1cm)를 고무 패킹을 배치. 완전히 바늘 홀더의 개구부에 삽입 된 고무 개스킷 홀더에 바늘의이면을 삽입한다. 다시 홀더 위에 팁을 나사. 바늘 조작기에 조립 된 바늘 홀더를 놓습니다. 수평에 가까운 바늘 홀더를 유지합니다. MICR 통해 볼 때 매니퓰레이터의 위치를​​ 조정하므로 니들의 팁은 뷰의 중심에 위치하고oscope. 바늘에 7 Frontloading의 dsRNA 솔루션 DDH 2 O와 농도를 조정하고 배 주입 버퍼 (단계 2.3) 같은 부피를 가진 dsRNA에 솔루션을 혼합하여 주입 직전에 dsRNA를 주입 솔루션을 준비합니다. 얼음에 혼합 용액을 보관하십시오. dsRNA에 농도에 대한 설명을 참조하십시오. 20 μL 일회용 피펫 팁의 끝을 잘라. 피펫 트리밍 피펫 팁에 용액 10 μL. 배압을 제공하여 팁의 유체를 유지하면서 조심스럽게 피펫 피펫 팁을 제거합니다. 선택적으로, 팁을주의 깊게 제거하고 손가락을 이용하여 압력을 제공하여 선단 단부에 용액을 이동. 바늘의 선단을 향하도록 개구 스티커 압정을 이용하여 현미경 스테이지 dsRNA를 용액으로 피펫 팁을 놓는다. 현미경을 통해 찾고, 천천히의 끝 때까지 바늘 방향으로로드 팁을 이동니들은로드 된 피펫 팁 내부 및 솔루션에 있습니다. 현미경을 통해 보면서 부드럽게 천천히 바늘에 dsRNA에 솔루션을 끌어 주입 주사기의 플런저를 다시 잡아 당깁니다. 참고 : 바늘을 너무 많이 넣지 마십시오. dsRNA를 용액의 단부는 바늘의 팁에 접근하면, 인상 속도를 느리게하고 공기 도달 할 바늘의 선단부 전 용액로드를 중지. 공기가 팁에 도달하는 경우, 용액을 급속하게 오염이 심각한 문제를 초래 바늘 홀더로 흡입된다. 바늘 홀더의 자세한 청소 절차는 필립과 Tomoyasu 2011 11에 설명되어 있습니다. 꼭지를 열어 주입 주사기와 바늘 홀더에서 압력을 제거합니다. 그런 다음, 바늘의 끝에서 멀리 피펫 팁을 이동합니다. 무대에 유충을 배치하는 동안 실수로 바늘의 손상을 방지하기 위해 무대에서 바늘을 올립니다. 무대에서 비워 피펫 팁을 제거합니다. </ol> 8 dsRNA를 주입 에테르 마취 바구니에 애벌레를 놓습니다. 기술을 학습보다 작은 경우 10 유충을 사용합니다. 기술로 한 번 편안한 한 라운드에서 30 ~ 40 유충을 사용합니다. 에테르 병에 애벌레와 바구니를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 참고 : 이더는 화재의 위험을 제시하고, 또한 유해. 흄 후드에서이 단계를 수행합니다. 약 3 분 Etherize 애벌레. 3 분 후 이동을위한 유충을 확인합니다. 그들은 여전히​​ 이동하는 경우 다른 30 ​​초 동안 에테르 병을 다시 배치합니다. 이 치사 성을 높일 수 있으므로 이상 5 분 etherize하지 마십시오. 참고 : 최적의 에테르 마취 시간은 온도와 습도에 따라 달라질 수 있습니다. 유리 스티커 슬라이드의 붙지 않는 가장자리로 바구니에서 에테르 화 유충을 전송합니다. 집게를 사용하여 현미경을 통해 보는 동안 한 각 유충 하나를 선택하고 슬라이드에 배치합니다. F 자신의 몸을 아래로 눌러 부드럽게 측면을 올려 놓고당신이가는대​​로 집게로 꼬리 롬 머리, 약간 그들은 슬라이드에 고정되어 있는지 확인하기 위해 그들을 스트레칭. 현미경 무대에서 유충으로 끈적 슬라이드를 놓습니다. 중추 신경계 손상을 방지하기 위해 유생의 등쪽으로 부드럽게 dsRNA를로드 바늘을 삽입합니다. 애벌레 마음이 여기에 위치해 있기 때문입니다 또한, 지느러미 중간 선을 피하십시오. 이 이후 단계에서는 항상 (대신 바늘을 이동하는 바늘 조작기를 사용하는) 바늘에 애벌레를 이동하는 단계를 사용합니다. 주 : 특정 주사 부위가 T.에서의 RNAi으로 문제가되지 않습니다 castaneum 전신이 나타납니다. 그러나, 흉부 또는 복부 세그먼트의 등쪽에 주입하는 것이 가장 쉬운 방법입니다. 유충에 바늘을 삽입 한 후, dsRNA에이 애벌레 체강를 입력 할 수있는 공간을 확보하는 데 약간 뒤로 바늘을 빼냅니다. 유충 턴 녹색 (또는 사출 버퍼의 색)까지 주입 주사기에 부드럽게 밀어의 모습tretched 및 전체. NOTE : 기술을 학습하면, 상당한 치사율없이 애벌레에 주입 될 수있는 용액의 양을 결정하기 위해 가능한 한 많이 주입하려고. 그것은 일반적으로 약 0.5 ~ 0.7 μL이다. 애벌레에서 바늘을 제거합니다. 바늘을 제거하는 동안 약간 뒤로 dsRNA에 손실을 방지 할 수있는 주입 주사기에 당겨 (도 공중에 끌어하지 않도록주의). 슬라이드의 모든 애벌레를 주입. 성공적으로 주입되지 않은 유충을 제거해야합니다. 유충이 완료되기 전에 주사 (약 10 분)에서 일어나. 주사 현미경에서 주입 애벌레와 슬라이드를 제거하고 모든 애벌레 에테르 마취에서 회복 될 때까지 더 5 분 동안 슬라이드를 둡니다. 집게와 해부 현미경, 부드럽게 끈적 슬라이드으로부터 그들을 석방을 위해 머리부터 꼬리까지 애벌레를 들어 올립니다. 깨끗한 페트리 접시에서 새로 출시 된 애벌레를 놓습니다. w 주입을 허용하도록 10-15 분 동안 페트리 접시에 유충 남기기응고 ound. 적절히 변형 이름을 포함한 클린 밀가루와 새로운 레이블 병으로 유충을 배치하는 dsRNA의 유형은, dsRNA를 농도, 주입 된 유충의 수, 및 날짜를​​ 주입. 문화 70 %의 습도가 30 ° C에서 주입 된 유충. 정기적으로 RNAi의 표현형의 유충을 관찰한다. 참고 : 7 일 이내 마지막 령 유충 번데기. (RNAi에 의한 타이밍에서 더 이상 존재하지 않는 경우) 다음에, 번데기 7 일후에 eclose 성인 것이다. 넉다운 및 표현형 분석의 9 확인 이러한 정량적 역전사-PCR (QRT-PCR)과 서양의 모래 바닥과 같은 여러 가지 분자 생물학 기술에 의해 아래로 노크의 RNAi의 평가의 효율성을 고려한다. 각각 밀러 등. 2,012 7 필립 상세한 qPCR에 대한 Tomoyasu 2011 (11)과 서쪽 오점 프로토콜을 참조하십시오. RNAi에 관련 표현형을 분석합니다. 참고 : 관련 RNAi에표현형은 표적 된 유전자에 따라 여러 다른 단계에서 및 다른 배양 조건 하에서 관찰 될 수있다. 의 RNAi는 딱정벌레의 형태, 변태, 생리학, 행동에 영향을 줄 수 있습니다. 얼마나 자주 표현형의 존재가 확인되고 딱정벌레 양육 조건이 특정 질문에 맞게 조정되어야 하는지를 아래는 RNAi를 통해 조사되고.