Larvaire interférence de l'ARN dans le rouge de la farine Beetle,<em> Tribolium castaneum</em

1 T. Stocks castaneum et la culture Décider d'un T. souche castaneum à utiliser pour l'expérience. NOTE: Plusieurs T. de laboratoire établi souches castaneum sont disponibles. Ga-1 (Géorgie-1) est la souche parentale de Ga-2 qui a été utilisé pour séquençage du génome 3. Depuis Ga-1 part la plupart des polymorphismes de l'ADN (tels que des polymorphismes nucléotidiques simples, ou SNP) avec Ga-2, et est plus sain que Ga-2 en raison de moins consanguinité, il est idéal pour les expériences de RNAi. Pu-11 est une autre souche pratique à utiliser , comme la protéine fluorescente jaune (EYFP) expression accrue unique dans l'avenir primordia de l'aile permet de distinguer le dernier stade larvaire d'autres stades (voir Figure S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 12). Il est important de documenter ce qui coléoptère souche a été utilisée dans l'expérience, en tant que fonds génétiques semblent nettement affect RNAi phénotypes 13. Préparer T. castaneum farine de culture par addition de 5% (en poids) de la levure de bière pré-tamisée à la farine de blé entier organique (après mélange, stocker la farine de culture à -20 ° C). Aliquoter la farine de culture (à température ambiante) dans six onces bouteilles en plastique Drosophila d'achat d'actions (environ 40 g / bouteille). Culture T. castaneum à 30 ° C avec 70% d'humidité. Utilisez un incubateur à humidité contrôlée, si possible. Ajouter 30-40 adultes par flacon de culture (ratio mâle: femelle 1: 1) pour démarrer la culture. NOTE: Bien que la moisissure est rarement un problème à 30 ° C, des températures plus basses (par exemple 25 ° C) avec 70% d'humidité peut provoquer la croissance de moisissures dans la farine de culture. Abaisser l'humidité si cela se produit. Transférer les adultes à un nouveau flacon de culture toutes les deux semaines pour le repiquage (voir l'étape 5.2 à 5.5 pour savoir comment isoler les adultes à partir de farine de culture). NOTE: Il faut environ trois semaines pour obtenir le dernier stade larvaire. Alternatvement, T. castaneum cultures peuvent être conservés à une température inférieure (20-25 ° C), mais avec une période plus longue mise en culture (temps de développement à 25 ° C est d'environ le double de celui à 30 ° C). 2 Préparation des solutions et instruments pour larvaire ARNdb injection Synthétiser des molécules d'ARNdb homologues au gène cible par transcription in vitro. Stocker à -80 ° C. Voir Philip et Tomoyasu 2011 11 pour les procédures détaillées de biologie moléculaire. Voir également la discussion d'un certain nombre de paramètres qui doivent être pris en considération lors de la conception des molécules d'ARN double brin. Ajouter 10 ml de tampon phosphate 0,1 M de sodium (pH 7,6 à 25 ° C) en mélangeant 8,5 ml de 1 M de Na 2 HPO 4 avec 1,5 ml de 1 M de NaH 2 PO 4. Vérifier le pH avec un pH-mètre et ajuster en conséquence. Ajouter 1 ml de tampon 10x par injection en mélangeant 10 ul de 0,1 M de tampon phosphate de sodium (pH 7,6 à 25 ° C), 100 _6; l de 0,5 M de KCl, 100 pi de colorant alimentaire vert, et 790 ul d'eau distillée deux fois (le trou DDH 2 O). Diluer le tampon 10x d'injection pour faire 2x tampon d'injection (200 pi de tampon 10x + d'injection 800 ul trou DDH 2 O). 10x et stocker à la fois des tampons 2x injection à 4 ° C jusqu'à utilisation. Préparez-it lames de verre. Couvrir une lame de verre entier avec une forme de colle repositionnable pour préparations injectables larvaires. Pour adultes ou des pupes injections, faire deux bandes minces de colle le long des bords plus longs de la diapositive. Laissez la colle sécher pendant plusieurs jours, ce qui assure que la colle reste assez collante pour adhérer coléoptères à la diapositive, tout en restant suffisamment souple pour faciliter leur enlèvement après l'injection. REMARQUE: Si la colle reste trop collante, utiliser un doigt et tapez sur la colle, ce qui permettra de réduire le pouvoir collant. Chaque diapositive peut contenir jusqu'à 40 ou 50 coléoptères, et peut être réutilisé jusqu'à ce qu'il ne parvient pas à tenir solidement les animaux. Alterntivement, ruban adhésif double face peut également être utilisé, bien que la bande est parfois pas adhésif suffisant pour contenir les larves. Faire un panier etherisation. Retirez le piston d'une seringue de 10 ml à usage unique, et couper la seringue dans la moitié autour de la ligne 6 ml. Jeter la moitié inférieure de la seringue. Brièvement chauffer la surface de la partie supérieure de la seringue avec un brûleur à gaz de coupe, et pousser rapidement la matière plastique fondue sur un morceau de maille de nylon pour coller le filet sur la seringue. Coupez l'excédent de maille, une fois le plastique durcit. Préparez la bouteille d'éther. Ajouter 30 ml d'éther dans un goulot étroit de 100 ou 250 ml flacon en verre. Ajouter plusieurs morceaux de papier de soie pour renforcer l'évaporation de l'éther. REMARQUE: Ether présente un risque d'incendie et est également néfaste. Toujours manipuler l'éther sous une hotte. Fermez le couvercle hermétiquement lorsqu'il n'est pas utilisé. NOTE: La glace peut être utilisé comme une alternative plus sûre (comme dans une salle de classe), bien que le sedation est moins efficace. 3 Préparation de larves d'appareils d'injection Passer une étape mécanique XY sur un microscope à dissection. REMARQUE: XY mécanique étapes sont disponibles auprès de grandes entreprises de microscope. Sinon, platines de microscope bon marché peuvent également être utilisés pour la plupart des microscopes de dissection avec quelques modifications (voir le tableau des matériaux par exemple). Placez un manipulateur d'aiguille mécanique près de la scène mécanique XY. Assemblage d'une seringue d'injection. Utilisation d'un robinet à quatre voies (avec des connexions Luer) pour connecter une ml seringue à usage unique 30 à un support d'aiguille de verre, ce qui permet la manipulation de la seringue d'injection, sans affecter la pression dans l'aiguille d'injection (voir Philip et Tomoyasu 2011 11 de la seringue d'injection détaillée assemblage). 4. aiguilles d'injection de traction Tirez aiguilles de verre borosilicate (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm de longueur) par unextracteur aiguille. REMARQUE: Pour Sutter P-87 ou P-97, utilisent le paramètre "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Temps = 90" ou suivez le chapitre 2 de la pipette Cookbook: cellules adhérentes, C. elegans, la drosophile, et le poisson-zèbre – programmes recommandés. Les paramètres optimaux varient en fonction du modèle de l'extracteur de l'aiguille. Le réglage de l'aiguille d'injection chez la drosophile générique est un bon point de départ. Magasin tiré aiguilles dans un boîtier en plastique (par exemple, un boîtier de CD en plastique) et le fixer avec du mastic de fixation amovible. 5 Isolement et sélection des larves Placez un tamis n ° 25 sur un récepteur de tamis. Placer le contenu du flacon de culture (coléoptères et de farine de culture) sur le tamis, et tamiser le contenu immédiatement. Ne laissez pas le contenu sur le tamis sans tamisage, car les larves rapidement essayer de creuser à travers le tamis et se coincer. Tamiser agressivement le contenu à laisser tomber la farineà travers et laisser les larves plus âgées (généralement de 6 ème et 7 ème stade larvaire), les nymphes et les adultes (avec leurs cuticules du casting-off, exuvies) derrière sur le tamis. Transférer le matériel restant sur le tamis (scarabées et exuvies) pour le bac de semences. Continuez à taper sur la casserole pour empêcher les insectes de s'échapper. Retirez le exuvies et les particules de farine restant sur la surface des coléoptères par soufflant doucement sur le plateau de semences. Appuyez sur le carter d'amorçage pour déplacer le contenu vers le fond de la casserole. Ensuite, laissez la casserole inexploité pendant plusieurs secondes. Attendez que les adultes, qui sont plus mobiles que les autres étapes, à sortir de la pile. Retirer adultes en utilisant un pinceau de l'art (par exemple, 1 cm de largeur). Nymphes séparé en frappant doucement la casserole de semences tout en gardant la bouche de la casserole légèrement vers le bas, sous forme de pupes ont tendance à rouler plus vite vers la bouche. Utilisez un pinceau pour retirer les nymphes, ne laissant que les larves sur le plateau de semences. Plas les larves isolé dans une boîte de Petri propre. Sélectionnez un stade approprié de larves pour injection et les placer dans une boîte de Pétri séparée. REMARQUE: Early dernier stade larvaire (1-2 jours après la mue larvaire) sont souvent approprié lors de l'analyse de l'effet ARNi sur la morphologie des adultes ainsi que sur la métamorphose. Il est cependant parfois nécessaire d'effectuer l'ARNi à l'avant-dernière (ou même plus tôt) étape pour évaluer la fonction du gène précoce (par exemple, les figures 3E-3H. Voir aussi Clark-Hachtel et al. 2013 12). Utilisation pupes comme référence de taille pour déterminer le stade de larves. Le dernier stade larvaire sont légèrement plus longues que les pupes. En variante, pu-11 peut être utilisé pour identifier le dernier stade larvaire et pour déterminer l'évolution temporelle de l'évolution du dernier stade larvaire (Figure S4 de Clark-Hachtel et al. 2.013 12). Gardez les larves sélectionné dans une boîte de Pétri jusqu'à etherisation. Placez le restede larves et d'autres étapes de coléoptères (tels que les nymphes et les adultes) de nouveau dans un flacon de culture avec de la farine et de le retourner à l'incubateur. 6 Préparation d'aiguilles d'injection Placer une aiguille de verre préalablement tiré sur une lame de microscope en verre en utilisant soit gommette ou un adhésif double face. En utilisant des pinces, tester la fin tiré de l'aiguille tout en regardant dans le microscope à dissection pour voir où les courbes de pointe. Prenez la zone légèrement vers le côté de la pointe de l'endroit où les virages en aiguille avec la pince et tourner à briser. Gardez de bonnes aiguilles et jeter autres. Considérons un bon aiguille ayant une ouverture qui est ni trop grand ni trop petit (environ 0,05 mm de diamètre. Figures 1A et 1B), et est inclinée à rendre la pénétration de la cuticule des larves plus facile (figures 1B et 2A-2B). Envisager une mauvaise aiguille (i) trop petit, ce qui rend l'absorption de la solution ARN double brin dans l'aiguille difficulte (étape 7) (figures 1D et 2D), (ii) trop grande, provoquant des blessures et des larves possible létalité lors de l'injection (figures 1C et 2F), (iii) émoussé, rendant la pénétration de la blessure difficile et de plus en plus cuticule. Insérer l'aiguille dans le porte-aiguille. Tout d'abord, dévisser la pointe du porte-aiguille et placez l'extrémité arrière de l'aiguille dans la pointe de titulaire. Ensuite, placez le joint en caoutchouc sous la pointe de titulaire (au moins 1 cm de l'extrémité arrière de l'aiguille de verre). Insérez l'arrière de l'aiguille dans le support, avec le joint d'étanchéité en caoutchouc complètement inséré dans l'ouverture du porte-aiguille. Vissez l'extrémité arrière sur le support. Placer le porte-aiguille monté sur le manipulateur d'aiguille. Maintenir le support d'aiguille proche de l'horizontale. Ajustez la position du manipulateur, de sorte que la pointe de l'aiguille se trouve dans le centre de la vue en regardant à travers le microscope. 7 Solution Frontloading ARN double brin dans l'aiguille Préparer la solution d'injection d'ARNdb juste avant l'injection par l'ajustement de la concentration avec le trou DDH 2 O et le mélange de la solution avec des volumes égaux d'ARNdb de tampon d'injection 2x (étape 2.3). Conserver la solution mixte sur la glace. Voir la discussion en ce qui concerne la concentration ARN double brin. Couper l'extrémité d'un embout de pipette jetable de 20 pi. Ajouter 10 ul de la solution dans l'embout de pipette garni. Retirez délicatement la pointe de la pipette de la pipette tout en gardant le liquide à la pointe en fournissant une contre-pression. Sinon, retirez délicatement la pointe et de passer ensuite la solution à la fin de la pointe en fournissant une pression avec un doigt. Placez la pointe de la pipette avec la solution ARNdb sur la platine du microscope à l'aide gommette avec l'ouverture vers la pointe de l'aiguille. En regardant à travers le microscope, se déplacer lentement vers la pointe chargé de l'aiguille jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est juste à l'intérieur de la pointe de la pipette et chargé dans la solution. Tout en regardant dans le microscope, tirez doucement sur le piston de la seringue d'injection à tirer lentement la solution ARN double brin dans l'aiguille. NOTE: Ne surchargez pas l'aiguille. Comme la fin de l'ARN double brin solution se rapproche de la pointe de l'aiguille, ralentir la vitesse de traction et arrêter le chargement de la solution avant la pointe de l'aiguille atteigne air. Si de l'air atteint la pointe, la solution sera établi rapidement dans le porte-aiguille, causant des problèmes graves de contamination. Procédures de nettoyage détaillées du porte-aiguille sont décrites dans Philip et Tomoyasu 2011 11. Retirer la pression de la seringue d'injection et le porte-aiguille par l'ouverture du robinet d'arrêt. Ensuite, déplacez la pointe de la pipette de la pointe de l'aiguille. Relevez l'aiguille en place de la scène pour éviter d'endommager accidentellement l'aiguille tout en plaçant les larves sur la scène. Retirez la pointe de la pipette vide de la scène. </ol> 8. ARNdb injection Placez les larves dans le panier de etherisation. Utilisez moins de 10 larves si l'apprentissage de la technique. Utilisez 30-40 larves en un seul tour, une fois à l'aise avec la technique. Placez le panier de larves dans la bouteille d'éther et fermer le couvercle. REMARQUE: Ether présente un risque d'incendie et est également néfaste. Effectuez cette étape sous une hotte. Larves étheriser pendant environ 3 min. Vérifiez les larves de mouvement après 3 min. Placez-les dans la bouteille d'éther pour un autre 30 secondes si elles sont toujours en mouvement. Ne pas étheriser plus de 5 min, car cela pourrait augmenter la létalité. REMARQUE: Le temps de etherisation optimal peut varier en fonction de la température et de l'humidité. Transférer les larves éthérée du panier au bord antiadhésive d'une lame de verre collante. En utilisant des pinces et en regardant dans le microscope, ramasser chacun de larves par un et les placer sur la diapositive. Disposez-les latéralement et tapoter sur leurs corps ftête de rom à la queue avec les pinces, les étirant légèrement que vous allez, pour s'assurer qu'ils sont fixés sur la lame. Placer la lame collant avec des larves sur la platine du microscope. Insérez l'aiguille chargée ARNdb doucement dans la face dorsale de la larve pour éviter d'endommager le système nerveux central. Evitez également la ligne médiane dorsale, comme le cœur larvaire se trouve ici. Dans cette étape et les suivantes, en utilisant toujours la scène à déplacer les larves à l'aiguille (au lieu d'utiliser le manipulateur d'aiguille pour déplacer l'aiguille). REMARQUE: Le site d'injection spécifique n'a pas d'importance que l'ARNi dans T. castaneum semble être systémique. Cependant, il est généralement plus facile à injecter dans la face dorsale des segments thoraciques ou abdominales. Après l'insertion de l'aiguille dans les larves, retirez l'aiguille légèrement vers l'arrière pour laisser place à l'ARN double brin à entrer dans la cavité de corps de la larve. Pousser doucement sur la seringue d'injection jusqu'à ce que la couleur verte des larves de tour (ou la couleur de la mémoire tampon d'injection) et de regardertretched et complet. REMARQUE: Si l'apprentissage de la technique, essayer d'injecter autant que possible afin de déterminer la quantité de solution qui peut être injecté dans une larve sans létalité importante. Il est généralement d'environ 0,5-0,7 pi. Retirez l'aiguille de la larve. Lors du retrait de l'aiguille, tirez légèrement sur la seringue d'injection pour éviter la perte ARN double brin (être aussi attention à ne pas tirer en l'air). Injecter toutes les larves de la diapositive. Veillez à supprimer les larves qui n'ont pas été injecté avec succès. Injection complète avant que les larves se réveiller (environ 10 min). Retirer la lame de larves injecté du microscope d'injection et laisser la lame pendant 5 min jusqu'à ce que plus toutes les larves se remettre de la etherisation. Avec des pinces et sous un microscope de dissection, soulevez doucement les larves de la tête à la queue pour les libérer de la diapositive collante. Placez les larves nouvellement libérés dans une boîte de Petri propre. Laisser les larves sur la boîte de Pétri pendant 10-15 minutes pour permettre l'injection wplaies à coaguler. Passer les larves dans un nouveau flacon avec de la farine et propre étiquette appropriée, y compris le nom de la souche, le type d'ARNdb injecté, la concentration de l'ARN double brin, le nombre de larves injectées, et la date. Culture du larves injecté à 30 ° C avec 70% d'humidité. Respecter les larves des phénotypes ARNi régulièrement. NOTE: La dernière nymphose de stade dans les 7 jours. Ensuite, les nymphes se Eclose en adultes après 7 jours (s'il n'y a pas d'anomalie dans le calendrier causée par ARNi). 9 Confirmation de sacrifiés et phénotypiques analyses Envisager d'évaluer l'efficacité de l'ARNi abattre par plusieurs différentes techniques de biologie moléculaire, tels que quantitative de transcription inverse-PCR (qRT-PCR) et Western Blot. Voir Miller et al. 2012 7 et Philip et Tomoyasu 2011 11 pour détaillé qPCR et Western Blot protocole, respectivement. Analyser les phénotypes liés ARNi. REMARQUE: ARNi connexesphénotypes peuvent être observées à plusieurs étapes et sous différentes conditions de culture, en fonction des gènes qui ont été ciblées. ARNi peut affecter le dendroctone morphologie, la métamorphose, la physiologie et le comportement. Combien de fois la présence du phénotype est cochée et dans quelles conditions les coléoptères sont élevés doivent être adaptées aux questions précises objet d'une enquête par l'ARNi.