Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien
Summary
Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.
Abstract
Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.
Introduction
Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten 1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität 3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Nanopartikel durch Elektronenmikroskopie (EM) zu sehen, ihre Verwendung zur korrelierten mikroskopische Analyse, die Kombination von Live-Cell-Tracking mit Lichtmikroskopie (LM) und eine höhere Auflösung bei ultrastruktureller Ebene mit EM 5 ermöglicht die Erleichterung. So wurden beispielsweise Gold-Nanopartikel lange Zeit effizient als Biosensoren in lebenden Zellen für empfindliche Diagnose sowie auf dem Gebiet der Immunmarkierung 6 verwendet wurde. Neueste sTUDIEN zeigen, dass Gold-Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe und Form kann leicht sein, die Aufnahme durch eine Vielzahl von Zelllinien und routinemäßig durch den endosomalen Weg zu transportieren, daher haben ein großes Potenzial für die intrazelluläre Vesikel Befinden Transportverfolgung und der endo-lysosomalen System Kennzeichnung angewandt 7,8 .
Mikrobiellen Krankheitserregern wie Salmonella enterica, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes, wurden verschiedene Mechanismen entwickelt, um nicht-phagozytischen Wirtszellen 9 einzudringen. Nachdem sie verinnerlicht, die Erreger entweder im Cytosol lokalisiert oder in membrangebundene Kompartimente abgesondert, interagieren intensiv mit ihrer Host-Umgebungen und moduliert diese auf ihr eigenes Überleben 10 begünstigen. Zum Beispiel befindet sich Salmonella enterica und repliziert in ein intrazelluläres phagosomalen Raum bezeichnet die Salmonellen-haltigen Vakuole (SCV) nach Infektion 11. Die Reifung SCVVerkehre zu den Golgi-Apparat, das fortlaufend Wechselwirkungen mit dem endocytischen und induziert die Bildung von ausgedehnten röhrenförmige Strukturen, wie Salmon -induzierte Filamente (SIF), Sortierung nexin Tubuli, Salmon -induzierte sekretorischen Trägermembranprotein 3 (SCAMP3) Tubuli, usw. . 12-14. Studium, wie diese bakterielle Erreger manipulieren Wirtszellsignalwege ist wesentlich für das Verständnis von Infektionskrankheiten.
Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System kennzeichnen, und der menschlichen Magen-Erreger Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Salmonella) wurde als Modellbakterium verwendet, um die Wechselwirkungen des Erregers mit dem Studium Gastgeber endocytischen. Intrazellulären Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel in nichtinfizierten Zellen und Zellen, die mit WT oder Mutante Salmonella-Stämmen infiziert wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) abgebildet.Dann wurde Imaris Software verwendet, um die Verteilung von Nanopartikeln zu quantifizieren, was anzeigt, daß Salmonella-Infektion induzierten extreme Umlagerung der Endosomen / Lysosomen. Nach der Beschreibung dieser Methode kann analoge Experimente entwickelt, um langfristige Schicksal der internalisierten NPs zu verfolgen und um den Einfluss der verschiedenen exogenen Substanzen oder endogenen Faktoren auf die endocytischen von eukaryontischen Zellen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation 17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in ze…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
Referenzen
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella – at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- . . LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
