Cerveau cellules myéloïdes caractérisation suivante course peut être réalisée par stéréologie selon la méthode de fractionnement optique, ou par une analyse de cytométrie en flux de cerveau leucocytes suspensions. Les deux sont des techniques utiles pour effectuer une distinction phénotypique précise des principaux sous-ensembles de cellules myéloïdes dans le cerveau ischémique.
activation de cellules microgliales, ainsi que l'extravasation des macrophages et des neutrophiles hématogènes, est censée jouer un rôle central dans les lésions cérébrales après un AVC. Ces sous-populations de cellules myéloïdes peuvent afficher différents phénotypes et fonctions et doivent être distingués et caractérisé pour étudier leur réglementation et leur contribution à des lésions tissulaires. Ce protocole prévoit deux méthodes différentes pour le cerveau immunitaire caractérisation des cellules: une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux. L'approche stéréologique est basé sur la méthode de fractionnement optique, qui calcule le nombre total de cellules dans une zone d'intérêt (cerveau infarci) estimée par un échantillonnage aléatoire systématique. La seconde approche de caractérisation fournit un moyen simple pour isoler des suspensions cerveau de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux, ce qui permet la caractérisation de la microglie, les monocytes et les neutrophiles infiltré du tissu ischémique. En outre, il a également DÉTAILS un modèle d'ischémie cérébrale chez les souris qui affecte exclusivement cortex cérébral, infarctus générer hautement reproductibles avec un faible taux de mortalité, et la procédure de traitement du cerveau histologique pour caractériser volume de l'infarctus par la méthode Cavalieri.
Morphologiques, phénotypiques et d'expression génique des altérations de la microglie, ainsi que extravasation et l'activation des macrophages et des neutrophiles hématogènes sont soupçonnés de jouer un rôle central dans la cascade physiopathologique suivante lésion cérébrale 1-4. Ce protocole fournit deux approches pour estimer le nombre de différents sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique et pour effectuer leur caractérisation phénotypique. En outre, il fournit également une description d'un modèle expérimental d'ischémie cérébrale chez les souris, qui consiste en la ligature transitoire ou permanent à la fois distale Artère cérébrale moyenne (MCA) et l'artère carotide commune (CCA), y compris la façon d'évaluer l'infarctus par la méthode Cavalieri précise en utilisant un logiciel stéréologique.
La première approche pour caractériser des sous-ensembles de cellules myéloïdes du cerveau ischémique est une méthode stéréologique basé sur l'approche de fractionnement optique 5. Ce est le pluscouramment utilisé sonde stéréologique en sciences de la vie et fournit un degré élevé de précision avec de faibles coefficients d'erreur 5-7. Ce est le meilleur choix pour la quantification de cellules lorsque le tissu est coupé en sections, car elle évite les biais sur l'estimation de la cellule en raison de la fragmentation du tissu en sections. Cette méthode est un moyen très puissant pour caractériser numéros, la dynamique et les changements phénotypiques des sous-populations de neutrophiles infiltrés du tissu ischémique 8.
La seconde approche de caractérisation est basée sur un protocole modifié à partir de Campanella et collaborateurs 9 qui fournit un moyen simple pour isoler cerveau suspensions de leucocytes et de les caractériser par cytométrie de flux. Contrairement aux techniques immunohistochimiques classiques, la cytométrie en flux caractérisation permet de différencier entre la microglie (CD45 lo CD11b +) et infiltré cellules myéloïdes (CD45 salut CD11b +) en fonction de leur diffles niveaux d'expression de CD45 Ørente 9-13. En outre, les monocytes pro-inflammatoires (CD45 salut CD11b + Ly-6G – Ly-6C salut), les neutrophiles (CD45 salut CD11b + Ly-6G +) et d'autres sous-ensembles de leucocytes le tissu ischémique peuvent être distinguées. Cette approche fournit un test fiable et rapide pour évaluer la neuro-inflammation dans des modèles expérimentaux de l'ischémie cérébrale. Cependant, le traitement des tissus peut influencer l'état d'activation et le nombre des différentes populations de cellules présentes dans le tissu ischémique fournir une caractérisation semi-quantitative.
Le modèle d'ischémie cérébrale présenté ici donne volumes d'infarctus hautement reproductibles déterminées 24 à 48 h et 7 jours après la ligature MCA par différentes approches 8,15,17. Ce modèle MCAO a un faible taux de mortalité (moins de 1%) par rapport aux autres, en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans les études. Une étape cruciale pour obtenir ce taux de mortalité est faible pour maintenir des conditions aseptiques appropriées pour éviter les infections qui pourraient nuire à la survie après un AVC induction. Ce modèle MCAO peut non seulement être utilisé comme un modèle MCAO permanente, qui est considéré comme un modèle pertinent clinique pour la recherche translationnelle 18, mais aussi comme un modèle transitoire par ligature transitoire de la CCA et le MCA avec un nœud coulant et la reperfusion postérieure à l'heure souhaitée 19. Cette méthode a été utilisée avec succès chez la souris et le rat 17,20. Toutes ces preuves indique que MCAO par ligature est un modèle polyvalent de haute de l'ischémie cérébrale avec de multiples applications. Un Critical étape de cette technique est qu'elle nécessite une intervention chirurgicale invasive sous un stéréomicroscope; la craniotomie doit être effectuée très soigneusement pour ne pas endommager l'os zygomatique ainsi que la MCA. Cependant, l'utilisation d'animaux fictifs (qui sont soumis à la procédure chirurgicale, mais CCA et MCA ligature ne est pas effectuée) fournit un outil utile pour distinguer les effets de la procédure dépendante chirurgicales. L'étendue de la lésion cérébrale suivant cette technique peut être quantifiée par plusieurs méthodes. Notre protocole de cerveau sectionnement, coloration de Nissl et estimation ultérieure du volume de Cavalieri permet une quantification précise de la zone endommagée et minimise le nombre de souris utilisées dans ce type d'études depuis des coupes de cerveau en série peuvent également être utilisés pour l'analyse immunohistochimique différente. Pour une meilleure performance de cette méthode, il est essentiel de choisir les paramètres appropriés utilisés dans le logiciel de stéréologie (tableau 1) qui sera nécessaire pour estimer evolume de e des différentes régions par la formule: V = 1 / ssf * a f * t * ΣP i (SSF est la fraction tranche d'échantillonnage, t est l'épaisseur moyenne des sections, un f est la zone de l'espacement de la grille et ΣP le nombre de points de frapper la structure).
Le MCAO distale par ligature peut être utile pour caractériser le leucocyte infiltré et sous-populations de cellules immunitaires 8,13 qui participent dans le processus inflammatoire qui suit une lésion cérébrale 1-4. Ici, nous proposons deux méthodes différentes pour la caractérisation des cellules immunitaires du cerveau, une approche stéréologique précis et une analyse de cytométrie en flux pour mieux caractériser plusieurs sous-populations de leucocytes.
Profitant de série cerveau sectionnement, la quantification du nombre total de neutrophiles peut être obtenue par le procédé de fractionnement optique 16, qui estime le nombre total de cellules à partir du nombre de cellules wit échantillonnéha systématique échantillonnés au hasard (SRS) ensemble de impartiales espaces de comptage virtuelles couvrant l'ensemble de la région d'intérêt, dans notre cas, la région de l'infarctus, avec une distance entre impartiales espaces de comptage virtuelles uniforme dans les directions X, Y et Z. Cette méthode fournit un outil précis pour estimer le nombre total de neutrophiles dans le cerveau ischémique à différents moments après la ligature. Même se il n'a pas été démontré dans cette étude, ce protocole peut également être utilisée pour l'estimation des différentes sous-populations de neutrophiles après une ischémie 21 et pour une quantification précise de toute autre population de cellules dans le cerveau ischémique comme les autres leucocytes infiltrés (monocytes / macrophages) et aussi pour estimer neurones survivants ou même pour la neurogenèse quantification après un AVC. L'étape la plus importante pour une estimation précise de la zone souhaitée est le choix des paramètres appropriés, comme ceux indiqués dans le tableau 3 pour la quantification des neutrophiles dans la zone ischémique.Ces paramètres seront utilisés pour le logiciel de stéréologie pour calculer le nombre total de cellules positives (N) en utilisant l'équation N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / TSF (ΣQ- est le nombre total de cellules comptées avec la colonne de fractionnement, SSF est la fraction d'échantillonnage de la section, asf est la zone de fraction d'échantillonnage et TSF est l'épaisseur de la fraction d'échantillonnage) 5. Bien que cette méthodologie est plus lent que les autres techniques de quantification (par exemple, l'analyse de marqueurs de neutrophiles par mg de tissu, la densitométrie des images ou le nombre de neutrophiles par champ représentatives), il a l'avantage d'être un neutre et une technique solide qui fournit une précision quantification du nombre de cellules.
La méthode d'isolement des leucocytes cerveau permet une identification et quantification simultanée de plusieurs sous-types de cellules immunitaires sans avoir à solliciter le système de coloration in vivo ou manipulations génétiques. Après le tri cellulaire à partir de la p myéloïde caractériséopulations ou leur séparation immunomagnétique peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval, tels que d'autres études sur expression génique ou protéique. La caractérisation précise de neutrophiles, monocytes et la microglie obtenus avec cette méthode fournit une grande spécificité par rapport aux méthodes existantes telles que les études immunohistochimiques, un avantage qui permet l'attribution des fonctions spécifiques aux différentes cellules myéloïdes qui interviennent dans le cerveau réponse immunitaire innée. En outre, il peut être étendu pour caractériser d'autres populations du cerveau avec l'étiquette appropriée, comme sanguins né macrophages (CD11b + CD45 + CD68 salut), et il peut être appliqué pour l'étude d'autres pathologies du système nerveux central ou des blessures. Par conséquent, cette technique fournit un outil essentiel d'explorer l'hétérogénéité de la réponse inflammatoire dans le cerveau. Une limitation principale de cette technique réside dans la préparation des suspensions de leucocytes à partir de tissu cérébral frais, ce qui peut altérer laétat d'activation des cellules ou leur modification antigène. Bien que cette technique permet une caractérisation qualitative plus détaillée par rapport à des études immunohistochimiques, il fournit une quantification moins précise basée sur l'isolement des cellules. Malgré cela, l'efficacité de notre protocole d'isolement des cellules est similaire à d'autres méthodes publiées 9 et il peut être efficacement utilisé pour détecter des différences dans le nombre de cellules immunitaires cérébrales entre les groupes témoins et MCAO ou même entre les groupes MCAO soumis à différents traitements 8.
Les étapes critiques de ce protocole sont la dissection des tissus, la procédure d'interruption de tissus, et la suppression de la myéline. En ce qui concerne le recueil de tissu, une étape de normalisation peut être inclus (en pesant le tissu collecté) pour éviter la variabilité due à différentes performances de dissection. En outre, la normalisation entre les différents groupes MCAO peut également se produire par volume de l'infarctus (préalablement déterminée par magnétique Resonance). Une autre façon de résoudre ce problème est d'utiliser l'ensemble de l'hémisphère ipsilatéral des deux groupes ischémiques et de contrôle, ou même utiliser l'hémisphère controlatéral de la souris ischémique comme un contrôle de minimiser le nombre d'animaux utilisés. Bien que cette approche permet d'éviter des différences entre chaque dissection, elle a un inconvénient majeur; un facteur de dilution est ajoutée en augmentant le nombre total de cellules, mais pas le nombre de cellules myéloïdes qui sont exclusivement situées dans la zone centrale et les zones péri-infarctus du cortex ipsilatéral. En ce qui concerne la perturbation des tissus, ce protocole illustre les étapes de la rupture mécanique des cellules du cerveau, en évitant les traitements enzymatiques et la prévention antigène de surface altération 9,22, une question essentielle pour la poursuite analyse qualitative et quantitative des sous-populations de cellules inflammatoires. En plus de la préparation de la suspension de cellules d'intérêt, l'enlèvement de la myéline à partir d'échantillons de cerveau est une étape très recommandée pour éviter les interférences avec downstapplications rame, comme la séparation immunomagnétique ou cytométrie de flux 23,24. Ceci peut être réalisé en utilisant différentes méthodes, comme le saccharose ou gradients de Percoll ou perles anti-myéline. Ici, et basée sur des études antérieures qui comparent différentes méthodes pour l'isolement de suspension des cellules du cerveau, une rupture mécanique en combinaison avec l'utilisation de Percoll pour enlever la myéline est utilisé pour améliorer les rendements et la viabilité cellulaire 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |