Brain myeloïde cellen karakterisatie volgende slag kan worden uitgevoerd door stereology de optische fractioneerinrichting methode of een flowcytometrische analyse van hersenen leukocyten suspensies. Beide zijn nuttige technieken om een nauwkeurige fenotypische onderscheiding van de belangrijkste myeloïde cel subsets in de ischemische hersenen voeren.
Microglia activatie en extravasatie van hematogene macrofagen en neutrofielen, wordt aangenomen dat het een belangrijke rol in spelen hersenletsel na een beroerte. Deze myeloïde cel subpopulaties kunnen verschillende fenotypes en functies weer te geven en worden onderscheiden en worden gekenmerkt om hun regelgeving en de bijdrage tot weefselschade te bestuderen. Dit protocol biedt twee verschillende methoden voor de hersenen immuun cel karakterisering: een nauwkeurige stereological aanpak en een flowcytometrische analyse. De stereological benadering is gebaseerd op de optische fractioneerinrichting methode, waarbij het totale aantal cellen berekent in een gebied van belang (infarct hersenen) geschat door systematisch steekproefsgewijs. De tweede kwalificatie aanpak is een eenvoudige manier om hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie, waardoor de karakterisering van microglia, geïnfiltreerd monocyten en neutrofielen van het ischemische weefsel. Daarnaast ook dIJZE een cerebrale ischemie model in muizen die uitsluitend van invloed op de hersenen cortex, het genereren van zeer reproduceerbare infarcten met een lage sterfte, en de procedure voor de histologische bewerking hersenen om infarctvolume karakteriseren door de Cavalieri methode.
Morfologische, fenotypische en genexpressie veranderingen van microglia, en extravasatie en activering van hematogene macrofagen en neutrofielen worden verondersteld een belangrijke rol spelen bij de pathofysiologische cascade na hersenletsel 1-4. Dit protocol geeft twee benaderingen schatting het aantal verschillende myeloïde cel subsets van de ischemische hersenen en hun fenotypische karakterisatie voeren. Daarnaast beschrijft ook een experimenteel model van cerebrale ischemie in muizen, die bestaat uit de tijdelijke of permanente ligatie van beide distale midden cerebrale slagader (MCA) en de gemeenschappelijke halsslagader (CCA), inclusief hoe het infarct evalueren Door de nauwkeurige Cavalieri methode waarbij een stereological software.
De eerste benadering myeloïde cel subsets karakteriseren van de ischemische hersenen een stereological basis van de optische fractioneerinrichting benadering 5. Dit is de meestveelgebruikte stereological sonde in life sciences en biedt een hoge mate van precisie met lage coëfficiënten van fouten 5-7. Dit is de beste keuze voor mobiele kwantificering wanneer het weefsel wordt gesneden in secties, zoals het voorkomt de bias op mobiele schatting omwille van de versnippering van het weefsel in secties. Deze methode is een zeer krachtige manier om cijfers, dynamiek en fenotypische veranderingen geïnfiltreerd neutrofiel subpopulaties van het ischemische weefsel 8 karakteriseren.
De tweede karakterisering benadering is gebaseerd op een gemodificeerd protocol van Campanella en medewerkers 9, die op een eenvoudige manier hersenen leukocyten suspensies isoleren en te karakteriseren door flowcytometrie bepaald. In tegenstelling tot conventionele immunohistochemische technieken, flowcytometrie karakterisering maakt onderscheid tussen microglia (CD45 lo CD11b +) en geïnfiltreerd myeloïde cellen (CD45 hi CD11b +) op basis van hun diffErent expressie van CD45 9-13. Bovendien, pro-inflammatoire monocyten (CD45 hi CD11b + Ly-6G – Ly-6C hi), neutrofielen (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) en andere leukocyten subsets van het ischemische weefsel te onderscheiden. Deze aanpak zorgt voor een betrouwbare en snelle test om neuroinflammation beoordelen in experimentele modellen van de hersenen ischemie. Echter, Weefselbewerkingswerkwijze de activeringstoestand en nummers van de verschillende celpopulaties in het ischemische weefsel die een semi-kwantitatieve karakterisering beïnvloeden.
De cerebrale ischemie model hier geïntroduceerd geeft zeer reproduceerbare infarct volumes bepaald 24-48 uur en 7 dagen na MCA ligatie door verschillende benaderingen 8,15,17. Dit MCAO model heeft een lage sterftecijfer (minder dan 1%) in vergelijking met anderen, het minimaliseren van het aantal dieren dat in studies. Een cruciale stap om deze lage sterfte te verkrijgen is om de juiste aseptische omstandigheden te handhaven voor infecties die overleven, kunnen gevolgen na een beroerte inductie te voorkomen. Dit MCAO model kan niet alleen worden gebruikt als permanent MCAO model, die als klinisch relevant model voor translationeel onderzoek 18, maar ook als tijdelijke voorbeeld door voorbijgaande ligatie van het CCA en MCA met een schuifknoop en achterste reperfusie op het gewenste tijdstip 19. Deze werkwijze is met succes gebruikt bij muizen en ratten 17,20. Al deze gegevens blijkt dat MCAO door ligatie is een hoog veelzijdige model van cerebrale ischemie met meerdere toepassingen. Een critical stap van deze techniek is dat het invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop vereist; de craniotomie moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om niet aan het jukbeen bot en beschadigen als het MCA. Echter, het gebruik van sham dieren (die is onderworpen aan de chirurgische procedure maar CCA en MCA ligatie niet uitgevoerd) een nuttig hulpmiddel voor chirurgie-afhankelijke effecten discrimineren. De omvang van hersenletsel na deze techniek kunnen worden met verschillende methoden. Onze protocol van hersenen snijden, Nissl kleuring en daaropvolgende schatting van het volume Cavalieri maakt een nauwkeurige kwantificering van het beschadigde gebied en minimaliseert het aantal muizen gebruikt in dit type studies aangezien seriële hersencoupes kan ook worden gebruikt voor verschillende immunohistochemische analyse. Voor een betere prestatie van deze methode, is het essentieel om de juiste parameters in de stereology software te kiezen (tabel 1) die nodig zijn voor het schatten the volume van de verschillende regio's van de formule: V = 1 / ssf * a f * t * i zp (Ssf het segment steekproeffractie, t de gemiddelde dikte van de secties, een f het gebied van de rasterafstand en zp het aantal punten raken van de structuur).
Het distale MCAO door ligatie kan nuttig zijn om het geïnfiltreerde leukocyten en immuuncellen subpopulaties 8,13 die aan het ontstekingsproces na hersenletsel 1-4 karakteriseren. Hier stellen we twee verschillende methodes voor de hersenen immuun cel karakterisering, een precieze stereological aanpak en een flowcytometrische analyse voor een betere karakterisering van meerdere leukocyten subpopulaties.
Gebruikmakend seriële hersenen snijden, kan de kwantificering van het totaal aantal neutrofielen worden bereikt door de optische fractioneerinrichting werkwijze 16 die het totale aantal cellen schattingen van het aantal cellen bemonsterde witha Systematische aselect verzameld (SRS) set van onpartijdige virtuele tellen ruimtes die de gehele regio van belang, in ons geval het infarct gebied, met uniforme afstand tussen onpartijdige virtuele tellen ruimtes in richtingen X, Y en Z. Deze methode biedt een nauwkeurig instrument om schatten totale aantal neutrofielen in de ischemische hersenen op verschillende tijdstippen na ligatie. Hoewel niet getoond in deze studie, kan dit protocol worden gebruikt voor de schatting van de verschillende subpopulaties neutrofielen na ischemie 21 en een nauwkeurige kwantificering van elke andere celpopulatie die in de ischemische hersenen zoals andere geïnfiltreerde leukocyten (monocyten / macrofagen) en ook voor het schatten overlevende neuronen of voor neurogenese kwantificering na een beroerte. De belangrijkste stap voor een nauwkeurige schatting van het gewenste gebied is de selectie van de geschikte parameters, zoals die aangegeven zijn in tabel 3 voor neutrofielen kwantificering in het ischemische gebied.Deze parameters worden gebruikt voor de stereology software om de totale positieve cel aantal (N) te berekenen met de volgende formule N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- is het totale aantal cellen geteld met de fractioneerinrichting, SSF is het gedeelte steekproeffractie, asf is het steekproeffractie gebied, en TSF is de steekproeffractie dikte) 5. Hoewel deze methode is langzamer dan andere kwantificatietechnieken (bijvoorbeeld analyse van neutrofielen markers door mg weefsel, densitometrie van representatieve beelden of het aantal neutrofielen per veld), heeft het voordeel een neutrale en een vaste techniek die een nauwkeurig bepaald te zijn kwantificering van celaantallen.
De hersenen leukocyten isolatie aanpak maakt een gelijktijdige identificatie en kwantificering van verschillende subtypen van immuuncellen zonder vertekening het systeem in vivo kleuring of genetische manipulaties. Latere celsortering van de gekarakteriseerde myeloïde populations of hun immunomagnetische scheiding kan worden gebruikt voor meerdere stroomafwaartse toepassingen, zoals verdere studies op gen- of eiwitexpressie. De nauwkeurige karakterisering van neutrofielen, monocyten en microglia verkregen met deze methode een hoge specificiteit met betrekking tot bestaande werkwijzen zoals immunohistochemische studies, een voordeel waardoor het specifieke opdrachten aan de verschillende myeloïde cellen die hersenen aangeboren immuunrespons mediëren. Bovendien kan het verder worden uitgebreid naar andere hersendelen populaties te karakteriseren met het geschikte label, zoals het bloed macrofagen (CD11b + CD45 hi CD68 +) en kan worden toegepast voor de studie van andere CNS aandoeningen of letsels. Daarom verschaft deze techniek een essentieel instrument om de heterogeniteit van de ontstekingsreactie in de hersenen verkennen. Een belangrijke beperking van deze techniek zich op de bereiding van de leukocyten suspensies verse hersenweefsel, die wegactivering toestand van de cellen of hun antigeen wijziging. Hoewel deze techniek maakt een meer gedetailleerde kwalitatieve karakterisering vergelijking immunohistochemische studies biedt een minder nauwkeurige kwantificering basis van celisolatie. Desondanks wordt het rendement van onze celisolatie protocol is vergelijkbaar met andere gepubliceerde methoden 9 en efficiënt worden gebruikt om verschillen in het aantal hersenen immuuncellen tussen controle en MCAO groepen of zelfs tussen MCAO groepen aan verschillende behandelingen 8 detecteren.
Kritische stappen van dit protocol zijn de weefsel dissectie, het weefsel verstoring procedure, en de myeline verwijderen. Ten aanzien van het weefsel collectie, kan een normalisering stap worden opgenomen (door weging van het weefsel verzameld) om de variabiliteit te voorkomen als gevolg van verschillende dissectie optredens. Bovendien kan normalisatie verschillende MCAO groepen ook optreden door infarct volume (tevoren door magnetische Resonance). Een andere manier om dit probleem op te lossen is om de gehele ipsilaterale hemisfeer van zowel ischemische en controlegroepen gebruikt, of zelfs de contralaterale hemisfeer van de ischemische muizen als controle om het aantal gebruikte dieren te minimaliseren. Deze aanpak vermijdt verschillen tussen elke sectie, heeft een nadeel; een verdunningsfactor wordt toegevoegd door het verhogen van het totale aantal cellen, maar niet het aantal myeloïde cellen die uitsluitend in de kern en peri-infarct gebied van de ipsilaterale cortex. Wat weefselverstoring dit protocol illustreert de stappen van de mechanische verbreking van hersencellen, vermijden enzymatische behandelingen en oppervlakteantigeen wijziging 9,22, een essentiële kwestie voor verdere kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de inflammatoire cel subpopulaties voorkomen. In aanvulling op de voorbereiding van de celsuspensie van belang, myeline verwijdering uit de hersenen monsters is een sterk aanbevolen stap om interferentie met downst voorkomenriem toepassingen, zoals immunomagnetische scheiden van cellen of flowcytometrie 23,24. Dit kan worden bewerkstelligd op verschillende manieren, zoals sucrose of Percoll gradiënten, of anti-myeline kralen. Hier, en op basis van eerdere studies die verschillende methoden voor de hersenen celsuspensie isolatie, mechanische verbreking in combinatie vergelijken met Percoll gebruik myeline verwijderen wordt gebruikt om cellen opbrengst verbeteren en de levensvatbaarheid 25.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) and RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), and from the Local Government of Madrid S2010/BMD-2336 (MAM) and S2010/BMD-2349 (IL). IB and MIC are fellows of the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
Polypropylene 50mL Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
FlowJo software | Treestar inc. | Software |