RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

Los estudios genéticos en los organismos vivos utilizan con frecuencia el embrión de pollo como modelo porque en la electroporación in ovo representa un modo rápido y barato para transfectar parcialmente estructuras embrionarias in vivo con construcciones de ADN ^1-5. Vectores de expresión bicistrónicos que codifican una transcripción que contiene un indicador fluorescente junto con el gen de interés, tales como pCIG ⁶ o ⁷ PMES, permiten una rápida verificación de la calidad de la transfección en la región deseada bajo un estereomicroscopio embriones antes de procesar para el análisis de aguas abajo.

Con los recientes avances en la secuenciación del ADN, ahora es posible obtener los perfiles de expresión del transcriptoma enteros digitales a partir de muestras de ARN usando ARN-Seq ^8,9. Por lo tanto, en lugar de los métodos que requieren mucho tiempo que permiten el análisis de los pocos productos de genes en paralelo, tales como la hibridación in situ, inmunohistoquímica y qPCR, preparación de bibliotecas de ADNc parasecuenciación de alto rendimiento puede proporcionar información de todo el transcriptoma. La observación de los efectos experimentales sobre los niveles de expresión de cada gen puede a su vez proporciona una visión de gran alcance en las vías alteradas por la construcción utilizada. Esto es particularmente fácil si un conjunto genómico para el organismo utilizado está disponible, por lo tanto el embrión de pollo de nuevo es un modelo adecuado.

Si el usuario tiene acceso a un centro de secuenciación del genoma fiable, la cuestión principal es la obtención de muestras de ARN de alta calidad. Este trabajo demuestra un método para la obtención de muestras de ARN a partir de tubos neuronales transfectadas adecuadas para la RNA-Seq, así como los pasos aguas abajo para análisis in silico de los conjuntos de datos resultantes. Después de la electroporación en HH12-13 seguido de 48 horas de incubación, tronco transfectadas mitades de la médula espinal fueron disecados en condiciones libre de ribonucleasa, inmediatamente zadas y más protegidos de la degradación por la ultra-bajo de congelación hasta la purificación de ARN y la biblioteca preparatde iones.

El servidor público de la galaxia ¹⁰ proporciona acceso a recursos gratuitos para el análisis de datos de secuenciación de alto rendimiento. La cantidad de espacio que ofrece a los usuarios registrados es suficiente para pequeños experimentos, eliminando así la necesidad de una infraestructura computacional local. Análisis de datos RNA-Seq incluye filtrado, la alineación y la cuantificación / comparación de la expresión génica. Aunque existen pautas generales para el análisis de datos RNA-Seq, parámetros de filtrado dependerá en gran medida de la calidad de la secuencia y se deben determinar después de un análisis de control de calidad de los datos en bruto.

Este protocolo describe los pasos para obtener y comparar los perfiles de ARN-Seq de pollo embrionario médulas espinales transfectadas in vivo. Como un resultado representativo, la comparación de conjuntos de datos obtenidos a partir de dos muestras de control independientes transfectadas con un vector vacío mostró que el método es reproducible y debería permitir la identificación de expres diferencialmentetranscripciones de sed en las muestras experimentales. Por lo tanto, la aplicación de este método tiene el potencial de aumentar enormemente el número de descubrimientos después de un solo experimento y por lo tanto proporcionar un conjunto grande de datos para la investigación posterior.