RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي
Summary
This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
Abstract
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Introduction
الدراسات الجينية على الكائنات الحية كثيرا ما تستخدم الجنين الدجاج كنموذج لأنه في Electroporation للالبيضة يمثل وسيلة سريعة وغير مكلفة لبالنقل جزئيا الهياكل الجنينية في الجسم الحي مع الحمض النووي يبني 1-5. ناقلات التعبير Bicistronic التي تكود نسخة واحدة تحتوي مراسل فلوري مع الجينات في المصالح، مثل pCIG 6 أو 7 pMES، يسمح بالتحقق السريع للجودة ترنسفكأيشن في المنطقة المطلوب بموجب stereomicroscope قبل معالجة الأجنة لتحليل المصب.
مع التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي، أصبح من الممكن الآن الحصول رقمية كاملة لمحات Transcriptome على التعبير من عينات الحمض النووي الريبي RNA باستخدام تسلسل 8،9. لذا، بدلا من الأساليب تستغرق وقتا طويلا التي تمكن من تحليل سوى عدد قليل من المنتجات الجينات في موازاة ذلك، مثل الموقع التهجين، المناعية وQPCR، وإعداد مكتبات [كدنا في ليمكن عالية الإنتاجية تسلسل تقديم المعلومات من Transcriptome على كله. يمكن ملاحظة آثار التجريبية على مستويات التعبير الجيني من كل واحد بدوره تقدم رؤى قوية على مسارات غيرت من التركيبة المستخدمة. هذا أمر سهل لا سيما إذا كان التجمع الجيني للكائن المستخدم هو متاح، وبالتالي فإن الجنين الفرخ هو نموذج مناسب مرة أخرى.
إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى مركز موثوق تسلسل الجينوم، القضية الرئيسية هي الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية. يوضح هذا العمل وسيلة للحصول على عينات من الحمض النووي الريبي من الأنابيب العصبية transfected مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي، وكذلك الخطوات اللاحقة للسيليكون في تحليل مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك. بعد Electroporation للفي HH12-13 تليها 48 ساعة الحضانة، تم تشريح الجذع transfected نصفين الحبل الشوكي في ظروف خالية من ريبونوكلياز، هي lysed على الفور وزيادة حمايتها من التدهور قبل منخفضة للغاية حتى تجميد تنقية RNA ومكتبة preparatأيون.
خادم العام غالاكسي 10 يوفر وصولا إلى تحرير الموارد لتحليل البيانات التسلسل الإنتاجية العالية. مقدار المساحة المعروضة للمستخدمين المسجلين يكفي للتجارب صغيرة، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى البنية التحتية الحاسوبية المحلية. ويشمل تحليل البيانات RNA يليها الترشيح، والمحاذاة والكميات / المقارنة بين التعبير الجيني. على الرغم من أن هناك مبادئ توجيهية عامة لتحليل البيانات RNA يليها، ومعايير الترشيح سيعتمد إلى حد كبير على نوعية التسلسل وينبغي أن تحدد بعد تحليل ومراقبة الجودة للبيانات الخام.
يصف هذا البروتوكول الخطوات للحصول على ومقارنة ملامح-RNA يليها من الدجاج الجنينية النخاع الشوكي transfected في الجسم الحي. نتيجة التمثيلية، وأظهرت المقارنة بين مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من عينتين مراقبة مستقلة transfected مع ناقلات الفارغة أن الأسلوب هو استنساخه وينبغي أن يسمح بتحديد اكسبريس تفاضليالنصوص سد في العينات التجريبية. وبالتالي، تطبيق هذه الطريقة لها القدرة على زيادة كبيرة في عدد من الاكتشافات بعد تجربة واحدة واحدة، وبالتالي توفير مجموعة كبيرة من البيانات للتحقيق لاحق.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا توفير مبادئ توجيهية لتحليل الآثار بعد Electroporation للمن الحبل الشوكي الدجاج. على الرغم من Electroporation للناقلات الحمض النووي هو أكثر كثيرا ما تستخدم لبإفراط عن الجين من الفائدة، ويمكن للمرء أيضا استخدام التركيبات ترميز السلبيات المهيمنة، والبروتينات quimeric أو السلائ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Indian ìnk | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| – 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| – 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| – ddH2O to 1 L | |||
| – Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| – 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| – ddH2O to 1 L and filter | |||
| – 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| – Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| – Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
Referenzen
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 .
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
