歯科用複合材料の細胞適合性評価のための効率的な方法として、共焦点タイムラプスイメージング

プロトコルは、3つの主要な手順で構成されます。最初のステップは、培養培地中で複合抽出物の調製を含み;第二の懸念初代ヒト歯肉線維芽（HGF）、細胞培養、複合抽出物および細胞染色による細胞の接触。第3のステップは、共焦点イメージング、蛍光信号解析で構成されています。服用歯肉組織の場合、プロトコルは、フランスの法律、インフォームドコンセント及び地域の倫理委員会に準拠して承認されました。 1.コンポジット抽出物の準備溶出媒体としてダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用します。試験片の表面積と抽出媒体の体積との比は、ISO 12分の10993要件の最低レベルであることを確認します。手順は、最近11を説明し、下に簡単に概説する。 オーダーメイドのホールドを使用して未硬化歯科複合材料の球状のサンプルを形成えー。ホルダーの大きさは、経口臨床治療において一般に助言硬化深度に応じた半径2mmである。 プレートのウェルを準備し、それぞれのペニシリン/ストレプトマイシン及びアンホテリシンの1％、5％のミックスが、ウシ胎児血清（FBS）を含まない培地を1ml（DMEM）を含む。 40秒間1070メガワットcm -2の強度（λ= 465から475 nm）を有するLEDライトランプを用いよく含むDMEM培地内で硬化サンプル。硬化先端とサンプル間の距離は0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。歯と未硬化歯科用複合の間の一時的な接触をシミュレートするために、この硬化モードを使用します。修復複合材料を口腔内に配置されたときに臨床的状況では、接触が起こる。 空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、37℃でのサンプル（DMEM培地中の複合試料）を培養する。同じ条件での対照細胞について（コンポジットサンプルなし）DMEM培地をインキュベートする。 2. HGF細胞培養、コンポジットエキステストと細胞の染色成長および細胞培養の維持ルーチン歯列矯正の抽出中に撮影患者の健康歯肉組織生検からヒト歯肉線維芽細胞を分離します。 10％FBSの存在下で、DMEM中のヒト歯肉線維芽細胞を養う、5％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％アンホテリシンBを、空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で細胞を維持する。 5日毎、3日毎に培地を変更し、継代細胞。トリプシン処理によりフルエンシー、収穫細胞に到達した後。 5分間90×gで遠心分離細胞培養培地中で再懸濁する。笏ハンドヘルド自動細胞計数器で細胞を数える。 チャンバースライドシステムにおいて2.5×10 4細胞/ mlの細胞密度でシード細胞懸濁液。 5％の雰囲気中で37℃で一晩細胞のインキュベーションを許可します。 培養中の細胞への複合抽出物のほか （インキュベーションの24時間後）は、試験した複合抽出物の1ミリリットルによってチャンバースライドの2井戸のメディアを交換してください。 同じ条件で、残りの2つのウェル（対照細胞）を維持する。 空気中5％CO 2の加湿雰囲気下、インキュベーター中、37℃で4つのウェルを含むチャンバースライドをインキュベートする。 蛍光染色メーカーの指示に従って、真核細胞のためのライブ/デッド細胞毒性ステインを使用してください。 注：このキットは、細胞膜の完全性およびエステラーゼ活性に基づいて、集団中の細胞の生存率を決定するための迅速な二色蛍光アッセイを提供する。染色を同時にmembranの損失を示すために、細胞内エステラーゼ活性を示し、赤色蛍光ジウムホモダイマー-1（のEthD-1）緑色蛍光カルセインAMで標識することによって損傷を受けた細胞からのライブ区別するEの整合性。 カルセインAM及び4μMとのEthD-1（線維芽細胞の染色に適していることが報告された最終濃度）の2μMを含む二つの染色試薬のワーキング溶液を調製する。選択された複合抽出物の存在下または非存在下で培養した接着細胞を染色を加える。 染色後とタイムラプスイメージングを通じて少なくとも15分で直接かつ迅速に染色された細胞集団を観察します。遠心操作は行なわないと染色された細胞をFIXEません。 3.共焦点タイムラプスイメージングと信号解析使用されるシステムは、4つのダイオードレーザユニットと各検体のために最大4つの蛍光色素のためのマルチ染色像を備えている。システムは、1つは関心（600X倍率）の領域を観察するために移動することができる上、試験サンプルの概要を示したマッピング像（倍率10倍）を行うことができます。 タイムラプスイメージング Sを配置共焦点統合インキュベーター（37の暗い部屋にpecimens（染色されたサンプルを含むチャンバースライド） °C、CO 2湿潤雰囲気の5％）。 対応するレーザーを選択します。カルセインとのEthD-1を励起するために2つのレーザ源を473 nmの（15 mW）とし、559 nmの（18 MW）を使用してください。 2使用済みの蛍光色素とイメージングにおけるクロストークずにライン配列を介して画像を取得するために2シーケンシャルモードを使用してください。 自動的に走査ユニット内の蛍光色素に応じた条件を設定し、新たに開発されたスペクトル検出器を用いる。 最大各チャンネルごとに検出された蛍光の帯域幅を最適化します。レコードに順次、すべての買収は、潜在的なクロストークを回避するため。 取得ソフトウェアを使用して、蛍光色素の選択に基づいて最適な撮影条件を選択してください。 、自動的に螺旋パターンで中心から作成された地図画像を取得する関心のある領域で簡単に綿密に検討するために選択されている。 観察モードを選択します。タイムラプス、Zスタック、および必要に応じて、多領域を含む観察モードの5種類まで選択。本研究ではZスタックとタイムラプスモードの組み合わせを使用して、迅速に撮影を完了蛍光色素を変更し、切り替えます。代替的に、互いに蛍光および光コントラスト画像を重ねる。左下地図画面上で選択したポイントを使用したライブ画像を観察する。 フレーミングを使用し、機能をズームにより撮影領域を決定します。必要に応じて、蛍光色素の種類ごとに表示の切り替え。 注：このプロトコルで使用される顕微鏡は、コンパクトな設計で高い従来の共焦点と同じ機能を持っています。顕微鏡は簡略化され、組み込みのインキュベーターとの生細胞の安定したタイムラプスイメージングのために最適に適して倒立水浸対物レンズが装備されています。 </lI> 信号解析および定量蛍光シグナルを定量化するイメージングソフトウェアを使用してください。試験される試料および細胞制御の両方のための10倍の対物レンズで5地図画像を取得します。 0.231ミクロン×0.231μmのピクセルサイズで、1024×1024画素の定期的な画像を得た。信号解析のためのオリンパスの画像フォーマットなどの画像（OIF）を保管してください。この形式は、さまざまなパラメータ設定や画像を一緒に保存することができます。別の解析ツール（強度プロファイルの測定二つ使用するチャネル間の強度比）を使用する。 12ビット/ピクセルのTIFFファイルとして最大の投影画像を保存する。 Rコマンダーソフトウェアを使用して統計分析をリフォーム。反復試験で一元配置分散分析（ANOVA）を使用して差異を分析する。報告書は、（±SD）として平均値、標準偏差およびp <0.05で統計的有意性をもたらす。