쥐과 밸브 내피 세포의 분리
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
성숙한 밸브는 심장 밸브 내피 세포 (vecS에서) 하나의 단일 층으로 전문화 된 세포 외 밸브 간질 세포 (VIC를) 산재 매트릭스 (ECM) 및 캡슐화의 세 층 화 층으로 구성되어 있습니다. ECM의 역할은 심장주기 동안 혈역학 힘 상수 변화를 견디도록 필요한 모든 생체 역학적 특성을 제공하는 것이다. 성인 밸브의 밸브 ECM의 회전율 단단히 크게 무부하 및 질병없는 섬유 아세포 등이다 VIC를 의해 통제된다. VIC 인구 이외에, 심장 판막 내피 세포 (vecS에서)은 교두 밸브 (2)의 표면 위에 중단 내피를 형성한다. 밸브 구조와 기능 및 VIC를위한 ECM의 중요성이 미국 및 다른 것들에 의해 설명되었지만, vecS에서의 역할은 덜 잘 알려져있다. 그러나, 이러한 비교적 작은 세포군은 배아에 밸브 형성 중요하며 밸브의 기능 장애로 설명질병.
방실 운하와 유출 기관 지역 내에서 내피 세포의 일부가 중간 엽 변환 (EMT) 및 심 내막 쿠션 1,3로 알려진 형태의 부종에 내피를 받아야 할 때 배아에서 심장 밸브 형성이 시작됩니다. 이러한 구조 내에서 새로 변환 된 중간 엽 세포는 나중에 VIC를로 분화 및 성숙 밸브를 형성한다. EMT가 완료되면, 쿠션 주위 내피 세포, vecS라고 지칭 부상 대 성숙한 밸브를 보호 중단 내피 세포층을 형성한다. 또한, vecS에서의 혈역학 적 환경을 감지하고 ECM은 1,3 항상성 조절하는 기본 VIC를 통신 분자 것으로 나타났다. 병 밸브에서, VEC 단층은 ECM 조직의 비정상적인 변화와 변경 생체 역학 4,5과 관련하여 중단된다. 게다가, 마우스 모델에서 연구 VEC 부전 밸브 (D)의 근본적인 원인임을 시사isease 1,6-9. vecS에서 밸브의 개발, 유지 및 질병에서 중요한 역할을 할 때, 우리가 충분히 미리 필드 및 질병의 메커니즘을 이해하기 위해 그들의 시간적인 표현형을 정의하는 것이 중요하다.
여러 실험실에 의해 이전 작업이 성공적으로 돼지와 네이쳐스 모델 10-12에서 vecS에서 격리하고있다. 이 때문에 밸브의 큰 크기로, 자성 비드와 세포 분리 단일 세포 클론 확장 순수한 11-13 개체군을 생성하는데 효과적이다 포함한 다른 분리 방법의 수에 따라, 보라고 및 / 또는 효소 분해를 통해 절연 부. 그러나, 이러한 모델 인해 높은 비용 이외에 분자 도구의 유용성을 제한하는 돼지 및 양 게놈 불완전한 주석으로 제한 될 수있다. 따라서 분리 한 후 돼지와 네이쳐스 vecS에서의 실험은 제한 될 수 있습니다. 마우스 모델 인해 유전 manipula위한 많은 가능성에 바람직기 및 배아와 성인 분자 도구는하지만, 지금까지 작은 동물 모델에서 더 VEC와 분리되어보고되지 않았다. 이는 현재시켜 항체 기반 격리 방법을 방지 VEC 특정 마커의 고유 한 정체성이 부족 소수 세포 인구를 포함 작은 조직 샘플 작업의 어려움을 가능성이있다.
이 문서에서는, 우리는 배아와 성인 단계에서 쥐 vecS에서 직접 분리하는 새로운 방법을보고합니다. 이 프로토콜은 모든 내피 세포 유형에 GFP를 표현하고 광범위하게 내피 세포 집단 (14)을 연구하는 데 사용 된 Tie2의-GFP 마우스, 활용합니다. 그러나,이 연구는 현재의 신규성은 처음 이들 생쥐, 밸브에서 내피 세포를 분리하기 위해 이용 된 점이다. 밸브 조직 및 FACS 정렬 뒤에 구 효소 digestions 일련의주의 절개함으로써 vecS에서 단리 될 수 있고, 각종 실험 기법을 사용직접 정렬 다음, RNA 추출과 문화를 CLUDING.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 처음 서술의 Tie2-GFP 마우스에서 배아 및 성인 뮤린 vecS에서의 분리를위한 신규 한 방법. 이 마우스 라인 광범위 내피 세포 집단의 분리를 위해 사용되었지만,이 vecS에서의 선택적 분리를 보여주는 첫 번째보고이다. 때문에 VEC 인구의 취약성, 우리는 배아와 성인 쥐의 심장 판막 긍정적 인 GFP (GFP 및 음수) 세포의 단일 세포 분리를 허용하는 엄격한 프로토콜을 개발했습니다. 의 Tie2-GFP 마우스 (14)로부터 전 배아 또는 기관을 사용하여 출판물에 비해, 우리는 세포의 집단을 분리 선택이 깨지기 내피 세포 집단의 낮은 풍부에 기초 콜라게나 및 절개 단계를 최적화했다.
VEC 아이솔레이션는 이전에 제한된 유전 적, 분자 생물학적 도구 큰 동물 모델에서보고되었다. 이러한 도구는 잘 따라서 ABI를 쥐에 설립된다뮤린 vecS에서 격리하는 품 질은 심장 판막의 연구에 사용되는 실험 디자인의 확장 집합을 허용한다. 따라서,이 방법의 중요한 장점은 vecS에서 야생형 마우스와 밸브 질환 및 상해의 모델로부터 시간적으로 분리 될 수 있다는 것이다. 두번째 장점은 절연 vecS에서보다 정확하게 생체의 상황을 반영하는 발현 패턴을 유지, 절개 후에 즉시 분석 할 수 있다는 것이다. 또한,이 분리 프로토콜 번호 팽창 및 시험 관내 환경에 의해 유도 따라서 전위 표현형 변화를 방지 할 수있다 세포 배양 물을 제거하기에 충분하다.
참신하고이 프로토콜의 실험적인 이점에도 불구하고, 우리는 한계가 여전히 존재 함을 인식하고 있습니다. 첫째, 밸브 내 뮤린 VEC 인구의 크기가 매우 작고, 따라서, 여러 타임 드 배아 담가가 유전자 발현 분석을위한 충분한 RNA를 생성하기 위해서 필요한 것이다. 생 동안S가 여러 브리더를 사용 극복 될 수 있고, 그것은 어떤 사후 분리 분석 툴의 적용에 영향을 미칠 수있다. 이 제한은 특히 분자 프로파일 및 기능적 어 세이를 포함 VEC 표현형의 더 철저한 분석을 수행하기 위해 GFP 양성 vecS에서의 합류 문화를 확립하기위한 도전이다. 그러므로 우리는 모든 어려움은 우리의 접근 방식에 의해 극복되고 있음을 인정하지만, 이것은 우리가 극복하기 위해 노력하고 있습니다 관심의 영역입니다.
판막 영역으로부터 분리 vecS에서의 이러한 접근법은 심실 내의 심근 내막 또는 혈관 구조 타이 GFP 이환 비 판막 내피 세포로부터의 오염의 가능성을 소개한다. 지금까지 다른 심장 혈관 내피 세포 집단에서 vecS에서의 분자 차이가 확인되지 않았다. 그러나 Nfatc1 유전자의 인핸서 영역을 파악하고 구체적으로 그렇지 않은 vecS에서 레이블을 보였다심장 (18) 내에서 EMT, 그리고 다른 내피 세포 인구를 받아야. Cre 호텔 모델 (Nfatc1합니다 사이트)를 구할 때, 미래 연구는 오염의 위험을 최소화하기 위해이 라인의 특이성을 활용할 수 있습니다. 비 판막의 Tie2 GFP–양성 세포 이외에, 밸브 전단지 중격 및 벽화 심근 벽의 윤대 영역에 부착 지점 근세포에서 오염 가능성은 항상 존재한다. 여기에 데이터가 표시되지 않음, 우리는 처음에 안티 GFP 및 항 CD31 항체로 코팅 된 복합 구슬을 사용하여 해부 판막 지역에서 vecS에서 격리하기 위해 연구를 시작했다. 이 방법은 내피 세포를 분리하는 성공 동안, 우리는 인접한 비 내피 세포 유형에서 유의 한 세포 덩어리를 경험 때문에 VIC를 심근 세포는 우리의 실험 샘플을 오염. 이 파라미터는 오직 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 설정되어있는 바와 같이 FACS 분석을 이용하여 회피되었습니다s 및 PCR 분석은 심근 특정 유전자의 발현이 제한 (그림 3)에 대한 통제했다 감지한다. 우리의 오염을 최소한으로 간주 될 수 있지만, GFP 및 내피 세포 특이 표면 마커의 선택과 배 향후 피할 수 전위 실험 복잡성 남아있다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 배아 성인 마우스 및이 방법은 RNA 분리 및 GFP 포지티브 및 네거티브 GFP 세포 집단의 세포 배양에 사용할 수있는 방법을 제공하는 실시 예에서 성공적 절연 vecS에서있다. 그러나,이 방법은 이러한 애플리케이션에 한정되지 않고, 분자 및 세포 기능 접근법의 과다에 사용될 수있다. 또한, 상기의 Tie2-GFP 배경은 건강과 질환에서 VEC 개체군의 비교 연구를 허용한다 유전자 마우스 모델과 교배 할 수있다. 이 신규 한 방법의 개발은, 처음으로, 집중 연구를 허용한다밸브 개발 및 유지 보수에 vecS에서의 기여를 검사하고 내피 의존 밸브 질병의 이전에 진가를 인정받지 못한 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 FACS 분석에 대한 기술 지원을위한 오하이오 주립 대학 종합 암 센터의 분석 세포 계측법 핵심 시설, 특히 카트리나 무어, 감사합니다. 또한 우리는 과학적 통찰력 박사 윌리엄 푸와 그의 그룹을 인식하고 있습니다. 이 작품은 NIH HL091878 (JL)과 전국 어린이 병원 심장 센터에 의해 지원되었다.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
Referenzen
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