Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen
Summary
The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Abstract
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
Introduction
Das reife Ventil aus drei geschichteten Lagen von spezialisierten extrazellulären Matrix (ECM) mit Ventilzwischenzellen (VIC) durchsetzt und eingekapselt durch eine einzige Schicht von Herzklappen Endothelzellen (VEC) 1 zusammengesetzt. Die Rolle der ECM ist, alle notwendigen biomechanischen Eigenschaften zu ständigen Änderungen der hämodynamischen Kraft während des Herzzyklus zu widerstehen. Umsatz des Ventil ECM im erwachsenen Ventil fest durch VICs weitgehend ruhenden Fibroblasten-ähnliche und in Abwesenheit von Krankheit geregelt. Neben dem VIC Bevölkerung Herzklappe Endothelzellen (VEC) einen ununterbrochenen Endothel über die Oberfläche der Klappensegel 2. Während die Bedeutung von ECM und VICs Ventil Struktur und Funktion sind von uns und anderen beschrieben wurde, ist die Rolle der VECs weniger bekannt. Jedoch ist dieser vergleichsweise kleinen Zellpopulation kritischen Ventilbildung im Embryo und als dysfunktional Ventil beschriebenKrankheit.
Herzklappenbildung im Embryo beginnt, wenn eine Teilmenge von Endothelzellen in den AV-Kanal und Ausflusstrakt Regionen unterziehen endotheliale mesenchymale Transformation (EMT) und Form wie Schwellungen Endokardkissen 1,3 bekannt. Die neu verwandelt mesenchymalen Zellen innerhalb dieser Strukturen später in VICs zu differenzieren und die reifen Ventile zu bilden. Sobald EMT abgeschlossen ist, Endothelzellen umgebenden die Kissen, genannt VECs, bilden eine ununterbrochene endothelialen Zellschicht, die die reifen Ventil vor Verletzungen schützt. Darüber hinaus erfassen die hämodynamische VECs Umwelt und haben gezeigt, dass molekular kommunizieren mit Basiswert VICs zu regulieren ECM Homöostase 1,3. In erkrankten Ventile wird die VEC-Monoschicht in Verbindung mit krankhaften Veränderungen in Organisation und ECM verändert Biomechanik 4,5 gestört. Darüber hinaus Studien in Mausmodellen zeigen, dass VEC Dysfunktion ist die zugrunde liegende Ursache der Ventil disease 1,6-9. Wie VECs spielen eine wichtige Rolle in der Ventil Entwicklung, Wartung und Krankheit, ist es wichtig, dass wir ihre zeitliche Phänotypen voll in Ordnung, um das Feld zu fördern und zu verstehen, Mechanismen der Krankheits definieren.
Frühere Arbeiten von mehreren Labors erfolgreich isoliert VECs aus Schweine und Schafen Modelle 10-12. Aufgrund der großen Grße dieser Ventile, Trennung durch Betupfen und / oder enzymatische Verdauung, gefolgt von einer Anzahl von verschiedenen Verfahren, einschließlich Isolierung magnetischen Kügelchen Zelltrennung und Einzelzell klonalen Expansion wirksam war, um reine Populationen 11-13 zu erzeugen. Allerdings können diese Modelle restriktiv sein aufgrund der unvollständigen Annotation von den Schweinen und Schafen Genome Einschränkung der Verfügbarkeit von molekularen Werkzeugen zusätzlich zu den hohen Kosten. Daher Experimente von Schweine-und Schaf VECs nach Isolierung können restriktiv sein. Mausmodelle sind bevorzugt wegen der vielen Möglichkeiten für die genetische Manipulationention und molekulare Werkzeuge in den Embryo und Erwachsenen, aber bis heute keine VEC-Isolationen in kleinen Tiermodellen berichtet worden. Dies ist aufgrund der Schwierigkeit bei der Arbeit mit kleinen Gewebeproben, die eine Minderheit Zellpopulation, die gegenwärtig nicht eindeutige Identität VEC-spezifischen Markern, wodurch Antikörper-basierten Isolationsverfahren umfassen wahrscheinlich verhindert.
In diesem Artikel, eine neue Methode zur direkten Isolierung von murinen VECs an embryonalen und adulten Stadien berichten wir. Dieses Protokoll nutzt Tie2-GFP Mäusen, die GFP in allen endothelialen Zelltypen zu äußern und wurden umfassend genutzt, um endotheliale Zellpopulationen 14 studieren. Jedoch ist die Neuheit dieser aktuellen Studie, dass diese Mäuse zum ersten Mal verwendet worden, um Endothelzellen von den Ventilen isolieren. Durch sorgfältige Dissektion der Klappengewebe und einer Reihe von neun enzymatischen Verdaus, gefolgt von FACS-Sortierung kann VECs isoliert und für verschiedene experimentelle Techniken verwendet werden,einschließlich RNA-Extraktion und Kultur, direkt nach Sortierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier erstmals beschreiben wir ein neues Verfahren zur Isolierung von embryonalen und adulten murinen VECs von Tie2-GFP-Mäuse. Während dieser Mauslinie wurde ausgiebig für die Isolierung von endothelialen Zellpopulationen verwendet wird, ist dies der erste Bericht zeigt selektive Isolierung von VECs. Wegen der Zerbrechlichkeit der VEC Bevölkerung haben wir eine strenge Protokoll, für Einzelzellisolierung von GFP positiven (negativen und GFP) Zellen von Herzklappen von embryonalen und adulten Mäusen ermöglicht. Im Vergleich zu der ursprünglichen Veröffentlichung mit ganzen Embryonen oder Organe von Tie2-GFP-Mäuse 14, haben wir Kollagenase und Dissektion Schritte auf der Grundlage der geringe Häufigkeit dieser fragilen endothelialen Zellpopulation, eine ausgewählte Population von Zellen zu isolieren optimiert.
VEC-Isolierungen haben bisher nur in Großtiermodellen mit begrenzten genetischen und molekularbiologischen Werkzeuge berichtet. Diese Werkzeuge sind in Mäusen festgestellt, und daher die ABIkeit murine VECs isolieren ermöglicht einen erweiterten Satz von experimentellen Designs für Herzklappen Forschung verwendet werden. Deshalb ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes, dass VECs kann zeitlich von Wildtyp-Mäusen, und Modelle von Klappenerkrankungen und Verletzungen isoliert werden. Ein zweiter Vorteil ist, dass VECs isoliert und fast sofort analysiert nach der Sektion, die Erhaltung Expressionsmuster, das die in vivo-Situation genauer zu reflektieren. Ferner ist diese Trennprotokolls ausreicht, um Zellkultur-Nr Expansion und somit potentielle phänotypischen Veränderungen durch die in vitro-Umgebung induzierten beseitigen verhindert.
Trotz der Neuerungen und experimentelle Vorteile dieses Protokoll, erkennen wir, dass Einschränkungen existieren noch. Erstens ist die Grße des VEC Bevölkerung im murinen Ventile sehr klein, und daher werden mehrere zeitlich embryonalen Würfe um ausreichend RNA für Genexpressionsanalyse zu erzeugen benötigt. Während this kann mit mehreren Züchtern überwunden werden, könnte es einen Einfluss auf die Anwendung von einigen Post-Isolierung Analyse-Tools. Diese Einschränkung hat sich besonders für die Einrichtung konfluenten Kulturen von GFP-positiven VECs um genauere Analysen der VEC Phänotypen einschließlich molekularer Profile und funktionelle Assays durchzuführen war eine Herausforderung. Daher bestätigen wir, dass nicht alle Schwierigkeiten wurden von unseren Ansatz zu überwinden, aber dies ist ein Bereich von Interesse, dass wir sind bestrebt, zu überwinden.
Dieser Ansatz zur Isolierung von VECs Klappen Regionen stellt die Möglichkeit einer Kontamination von Tie-GFP-positiven, nicht-valvulärem Endothelzellen der Endokard oder Gefäßstrukturen im Myokard. Bisher wurden molekulare Unterscheidung VECs von anderen Herz endothelialen Zellpopulationen nicht identifiziert. Jedoch ein Enhancer-Region des NFATc1 Gen identifiziert und gezeigt, spezifisch zu markieren, die nicht VECsEMT unterziehen, und keine andere endotheliale Zellpopulation innerhalb des Herzens 18. Als Cre-Modell (NFATc1 ENCRE) verfügbar ist, könnten zukünftige Studien die Spezifität dieser Linie nutzen, um Kontaminationsrisiken zu minimieren. Zusätzlich zu nicht-Klappen Tie2-GFP-positiven Zellen, besteht immer die Möglichkeit einer Kontamination von Myozyten an dem Punkt, wo die Klappensegel zu befestigen an den ringförmigen Bereich des septalen und Wand myokardialen Wände. In der Daten hier nicht dargestellt, zunächst begannen wir Studien, um VECs von seziert Klappen Regionen mit Antikörper-konjugierten Perlen mit anti-GFP und anti-CD31 beschichtet isolieren. Während dieser Ansatz erfolgreich zur Isolierung der Endothelzellen war, erlebten wir eine signifikante Zell Verklumpung von benachbarten, nicht-endothelialen Zelltypen und damit VICs und Herzmuskelzellen verunreinigt unsere experimentellen Probe. Dies wurde mit Hilfe der FACS-Analyse als Parameter eingestellt sind, nur Einzelzellsuspension zu isolieren vermiedens und die PCR-Analyse zum Nachweis der Expression Myocyten-spezifischen Gene für diese Begrenzung (3) gesteuert wird. Während unsere Verunreinigung als minimal erachtet werden, bleibt es ein Potential experimentellen Aufwand, der in der Zukunft mit der Doppelselektion von GFP und Endothelzell-spezifische Oberflächenmarker vermieden werden.
Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich isoliert VECs von embryonalen und adulten Mäusen und bereitgestellt Beispiele, wie dieser Ansatz für die RNA-Isolierung und Zellkultur von GFP und GFP positive negativen Zellpopulationen verwendet werden. Jedoch ist dieser Ansatz nicht auf diese Anwendungen beschränkt und kann für eine Vielzahl von molekularen, zellulären und funktionalen Ansätze verwendet werden. Darüber hinaus kann der Tie2-GFP Hintergrund mit genetischen Mausmodellen, die für Vergleichsstudien von VEC Bevölkerung in Gesundheit und Krankheit ermöglichen wird gezüchtet werden. Die Entwicklung dieser neuartigen Methodik wird, zum ersten Mal, ermöglichen gezielte StudienPrüfung der Beitrag der VECs in Ventil Entwicklung und Wartung und konnte bisher unbeachtet Mechanismen der endothelialen abhängige Klappenerkrankungen zeigen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical Cytometry Core Facility, speziell Katrina Moore, für die technische Unterstützung bei der FACS-Analyse. Darüber hinaus erkennen wir, Dr. William Pu und seine Gruppe für ihre wissenschaftlichen Erkenntnisse. Diese Arbeit wurde vom NIH HL091878 (JL) und das Herzzentrum bei Nationwide Kinderkrankenhaus unterstützt.
Materials
| [header] | |||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
Referenzen
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