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Neurowissenschaften

Einseitige Pyramidotomy der Pyramidenbahn in Ratten für Bewertung der Neuroplastizität treibenden Therapien

Published: December 15, 2014
doi:
10.3791/51843
, , , , ,
1Neurorestoration, Wolfson Centre for Age-Related Diseases,King’s College London, 2Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Die Pyramidenbahn, einer der wichtigsten sensomotorischen Striche können einseitig in das Nagetier brainstem um neuroplasticity induzierenden Therapien für das zentrale Nervensystem zu testen läsionierten werden. Dieses chirurgische Verfahren ("pyramidotomy") und postoperative Beurteilungen werden in diesem Protokoll beschrieben.

Abstract

Die Pyramidenbahn (CST) kann komplett einseitig in den Markpyramiden der Nagetier-Hirnstamm durchtrennt werden. Das CST ist ein Motor-Darm-Trakt, die große Bedeutung für distale Muskelkontrolle bei Menschen hat und, in geringerem Maße, in Nagetieren. Eine einseitige Schnitt einer Pyramide führt zu einem Verlust der CST Innervation des Rückenmarks vor allem auf der kontralateralen Seite der Wirbelsäule, die zu vorübergehenden Motorunfähigkeit in den Vorderbeinen und anhaltende Verlust der Beweglichkeit. Ipsilateralen Projektionen der Pyramidenbahn sind gering. Wir haben unsere chirurgische Methode, um die Chancen zu erhöhen Läsion Vollständigkeit verfeinert. Wir beschreiben postoperativen Pflege. Defizite auf dem Montoya Treppe Pellet Erreichen Test und dem hier gezeigten horizontalen Leiter Test werden bis zu 8 Wochen nach der Verletzung festgestellt. Defizite auf dem Zylinder Aufzucht Test werden nur vorübergehend erkannt. Daher kann die Zylinder Test nur zur Detektion von kurzfristigen Erholung. Wir zeigen, wie, elektrophysiologischund anatomisch, kann man Läsionen und plastischen Veränderungen zu beurteilen. Wir beschreiben auch, wie Fasern aus dem unverletzt CST sprießen über die Mittellinie in den benachteiligten Gebieten analysieren. Es ist schwierig zu> 90% komplette Läsionen durchgängig zu erhalten wegen der Nähe zu der Arteria basilaris im verlängerten Mark und Überlebensraten niedrig sein kann. Alternative Operationstechniken und Verhaltenstests werden in diesem Protokoll beschrieben. Die pyramidotomy Modell ist ein gutes Werkzeug für die Bewertung der Neuroplastizität treibenden Behandlungen, die Keimung von intakten Fasern nach einer Verletzung zu erhöhen.

Introduction

Die Pyramidenbahn (CST) ist einer der Hauptmotor Wege im menschlichen Rückenmark. Schäden an diesem Trakt nach Verletzungen des Rückenmarks führt zu erheblichen Verlust der Fingerfertigkeit. Die CST ist besonders wichtig für feinmotorische Bewegungen beim Menschen, wie stelligen Bewegung und distalen Muskelkontrolle. Es wird auch in Nagetieren obwohl seine anatomische Lage innerhalb des Rückenmarks ist anders als die des Menschen und CST Schäden geringer Deaktivierung 1-4.

Ein in vivo Modell CST Verletzung schließt eine einseitige pyramidotomy, wobei eine Pyramide im ventralen Hirnstamm rostral des Kreuzung (Figur 1) zu schneiden. Die Pyramiden sind ein deutliches anatomisches Merkmal auf der Bauchseite der Medulla oblongata, durch die das CST läuft, bevor es decussates. Bei Ratten ist die Mehrzahl der Fasern (etwa 95%) decussate am kaudalen Ende der Medulla und danach im dorsalen medialen Teil des Rückenmarks zu finden. Allerdings approximately 10% der decussated Fasern verlaufen in den dorsolateralen Spalten. Die verbleibende ~ 5% Fasern bleiben uncrossed auf der ipsilateralen Seite und Reisen im ventralen medialen Teil 5,6. Nach pyramidotomy das Rückenmark verliert seine direkte Eingabe von dem kontralateralen CST (Abbildung 1).

Die pyramidotomy Modell ist besonders gut für die Prüfung der Antworten der intakten Fasern des unverletzten CST einer Behandlung. Es ermöglicht Beurteilung Plastizität und Sprossung der intakten Fasern über die Mittellinie des Rückenmarks, die die denervierten Bereichen innervieren. Die Pyramidenbahn wurde beobachtet, dass sich in den Rückenmarksverletzung Modelle sprießen und vermittelt insbesondere forelimb Recovery 7-10. Eine Behandlung könnte darauf abzielen, diese forelimb Wiederherstellung zu verbessern. Die Wirksamkeit einer Therapie mit Verhaltensprüfungen, anatomischen Verfolgungstechniken der unverletzten Trakt und Klemmenelektrophysiologischen Experimenten 3,11,12 getestet werden. </ P>

Der Vorteil im Vergleich zu den meisten anderen präklinischen Modellen von Rückenmarksverletzungen ist, dass es speziell betrifft eine Wege im Vergleich zu anderen Wirbelsäulenverletzungen oft, die mehrere Verträge. Nur ein Trakt in einer klaren, oberflächliche anatomische Lage ist verletzten. Ein weiterer Vorteil ist, dass die pyramidotomy ist eine reproduzierbare Verletzungsmodell. Es ist eine geeignete In-vivo-Ressource für Forscher, um die Auswirkung von potenziellen Neuroplastizität treibenden Therapien, die auf Wiederherstellung der motorischen Funktion nach Verletzungen oder Erkrankungen der motorischen Systems 13,14 Ziel zu testen.

Protocol

Ethics Statement: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des britischen Innenministeriums und Tiere (Scientific Procedures) Act von 1986. 1. Chirurgie und Verletzung HINWEIS: Die Verwendung Ratten schwerer als 220 g mit postoperative Genesung zu helfen, wenn der Chirurg findet Tiere verlieren oft mehr als 10% ihres präoperativen Körpergewicht. Vor der Operation testen, die Tiere für ihre Vorderpfote bevorzugt mit dem Zylinder Aufzuchttest 15 oder der Montoya staicase Test 24. Vorzugsweise schneiden die Pyramide / der CST, der dem dominierenden Vorderpfote. HINWEIS: Zwei Tage vor der Operation, legen Sie die folgenden Punkte in die Käfige, so dass die Ratten, die mit Lebensmitteln, die während der Erholung von der Operation von Vorteil sein wird, vertraut machen: Hydrogel-Packs, nassen Brei und hochkalorische Nahrungsergänzungsmittel. Sterile Versionen dieser Nahrungsergänzungsmittel werden von verschiedenen Anbietern. Anesthetize weiblichen Lister Kapuze Ratten (Gewicht zwischen 200 und 250 g) mit Isofluran (5% für die Induktion und 1 bis 2% für die Wartung) in Sauerstoff (Leistung: 1,5 l / min). HINWEIS: Die Wahl des Anästhetikums ist wichtig. Inhalationsanästhetikum ermöglicht eine schnellere Regelung der Tiefe der Anästhesie als Ketamin, die auch häufig verwendet wird. Isofluran ermöglicht eine bessere Kontrolle der Atmungsfrequenz und der Tiefe. Die Wahl der Betäubung ist Isofluran. HINWEIS: Die Verwendung Ratten schwerer als 220 g mit postoperative Genesung zu helfen, wenn der Chirurg findet Tiere verlieren oft mehr als 10% ihres präoperativen Körpergewicht. Verwalten Carprofen subkutan als Analgetikum, wenn die Tiere betäubt, um Entzündungen zu behandeln und zu Analgesie. Hinweis: Carprofen während pyramidotomy Chirurgie in unserem Labor nach unserem Tierarzt beraten. Opioide können weitere Atemdepression während der Operation führen. Während der Operation die Tiere bei 37 ° C zu halten mit einem Heim-exotherme Decke-System und eine rektale Temperatursonde. Bestätigen Sie Vollnarkose, indem Sie für die Pfote Prise Rückzug Reflex und der Blinkreflex. Hinweis: Optional: Atemprobleme während der Operation, Intubation und Beatmung begegnen könnte machbar sein. Aber bedenken Sie, dass die Luftröhre muss während der Operation verschoben werden. Einmal betäubt, legen Sie die Ratte in Rückenlage, rasieren die ventrale Hals und sterilisieren Sie es mit 1% Chlorhexidin Tücher und / oder Alkoholtupfer. Tragen Sie eine sterile OP-Decke über das Tier und steril zu allen Zeiten das Gebiet. Einmal betäubt, legen Sie die Ratte in Rückenlage, rasieren die ventrale Hals und sterilisieren Sie es mit 1% Chlorhexidin und Alkoholtupfer. Tragen Sie eine sterile OP-Decke über das Tier und steril zu allen Zeiten das Gebiet. HINWEIS: Optional kann Kopf der Ratte in einem stereotaktischen Rahmen in der Rückenlage während der Operation festgelegt werden, um die Mobilität des Kopfes, dh deaktivierender Hinterhauptbein. Machen Sie eine 2 bis 3 cm langen Mittellinienschnitt vom Kinn bis fast rostralen Ende des Brustbeins mit einem sterilen Skalpell (# 10). Optional gelten kleine Bulldogge Schellen, um die Haut zu widerrufen. Blunt die oberen Schichten der Gewebe wie Drüsen (zB Unterkieferdrüse und Ohrspeicheldrüse) und die Muskeln für den Luftröhre mit umgekehrter Wirkung mit stumpfen Schere und Zahnzange sezieren. Bleiben Sie immer auf der Mittellinie. Die Gewebe sollten leicht zu trennen. Nachdem die Luftröhre freigelegt ist, verdrängen sie zur Seite. Die Mittellinie ist darunter mit zwei weißen Fettpölsterchen sichtbar, Kennzeichnung der Mittellinie an der rostralen Ende. Rostra zu den weißen Fettpolster, stumpf sezieren Gewebe, bis der ventralen Oberfläche des Schädels (die Basioccipitale Knochen) erreicht ist. Legen Langzahn Retraktoren (Zahnlänge 5,5 mm oder 16 mm), um die Luftröhre zu einer Seite (maximal 1 cm) verdrängt zu halten und die Basis des Schädels aus. Verschiebung der Luftröhre OBstruct Atmung. HINWEIS: Bei einigen Tieren, lösen Sie die Retraktoren auf mehrere Male während der Operation, um die Belastung für die Luftröhre alle 10 min für 2 min zu entfernen, zum Beispiel. Wundhaken kann anstelle von Langzahnwundhaken verwendet werden, um die Belastung der Verschiebung zu reduzieren. Sorgfältig kauterisieren kleine sichtbare Blutgefäße an der rostralen Ende in Richtung des Kehlkopfes, um Blutungen zu vermeiden. HINWEIS: Um kauterisiert die Recurrens Blutgefäße werden sorgfältig zog sich von der Gewebewand, bevor sie geätzt werden, um zu verhindern. Stellen Sie das Mikroskop für den Rest der Operation. Entfernen Sie die Beinhaut für die Basis des Schädels mit feinen Pinzette. Passen Sie die Wundhaken, um die beste Sicht für das Bohren zu erreichen. Spüren Sie die unebene Oberfläche des Basioccipitale Knochen mit feinen Pinzetten und stellt fest, eine Erhöhung an der Mittellinie, die die A. basilaris abdeckt. Rostral, wird der Schädel als eine leichte Wölbung erhöht. Je nachdem, welche Seite die Läsion gewünscht ist, bohren Sie ein Loch in etwa 1 mm lateral der Mittellinie in mediolateral Bewegungen. HINWEIS: Denken Sie daran, dass die Ratte ist in Rückenlage, und die linke Seite auf der Ermittler rechten Seite! Sobald ein Loch gemacht wird, vergrößern zur Mittellinie mit kleinen vertikalen Aufwärts- und Abwärtsbewegungen mit dem Bohrer, bis die Basilararterie deutlich sichtbar ist und sich seitlich erweitern mindestens 2 mm. Sicherstellen, dass die A. basilaris deutlich sichtbar ist. Die Pyramide kann durch seine leicht gewölbten Form (Abbildung 2) und von angrenzenden Blutgefäßen identifiziert werden. Nehmen Sie die restlichen Knochenfragmente mit feinen Pinzette. Einen Tropfen Doxapram Hydrochlorid, einem Atmungsreizmittel, auf der Zunge. Öffnen Sie die Dura in Längsrichtung mit einer 26-Gauge-Nadel und feinen Pinzette lateral der A. basilaris. Genießen Sie die Rückenmarksflüssigkeit (CSF) und jede Blutung mit Wattestäbchen. Vermeiden Injury in die A. basilaris, einen Schnitt etwa 1,5 mm breit über die gesamte Breite der Pyramide und 0,5 mm tief mit Vannas Frühling Schere senkrecht zur A. basilaris (Abbildung 2), die CST-Fasern zu unterbrechen. HINWEIS: Markieren Sie die Mikroschere zuvor bei 0,5 mm von den Spitzen. Nachdem die Dura geöffnet die A. basilaris kann leicht zu einer Seite erlaubt einen besseren Zugang zu der Pyramide bewegt werden. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Spitze eines 26-Gauge-Nadel, um sicherzustellen, die Läsion sind die Fasern in der Nähe der Arteria basilaris. Die Blutung zu stoppen mit leichtem Druck von Wattestäbchen aufgetragen. Wahlweise kann der Schnitt mit Gelfoam abgedeckt werden. Entfernen Sie die Wundhaken, ersetzen Sie die Gewebe und Naht nur die Haut mit 3-0 Vicryl Nahtmaterial. Nach der Operation erhalten die Tiere in einem Brutschrank bei 32 ° C bis zum vollständigen Aufwachen und zu verwalten, 5 ml Kochsalzlösung subkutan, falls erforderlich. Stellen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen. Geben Carporfen subkutanals entzündungshemmendes und als Analgetikum für die postoperativen Schmerzen 1 Tag nach dem Eingriff. Überwachen Tiere genau eine Woche nach der Operation und mindestens einmal in der Woche danach. Als nach der Operation, Ort Trink Gel-Packs, pürierte Babynahrung, nassen Brei und trocken Chow auf Käfigboden erforderlich. Geben Sie Wasserflaschen mit langen Tüllen (ohne Kugellager Ventile).

Representative Results

Die Überlebensraten. In einer repräsentativen Studie von uns durchgeführten hatten wir eine Überlebensrate von 16 von 20 weiblichen Lister Kapuze Ratten (200-250 g). Die häufigste Komplikation ist Atembeschwerden, weil der Luftröhre Verschiebung oder Beschädigung der Atemzentren im Hirnstamm genau zu den Pyramiden (Nucleus solitarii, mehrdeutig und parabrachilis) dorsal. Ähnliche Ergebnisse wurden in der Literatur 16 gemeldet. Verhaltens Ergebnisse. Eine Reihe von Verhaltenstests wurden zur sensomotorischen Ergebnis nach pyramidotomy bei Nagetieren zu bewerten: die horizontale Leitertest, dem einzigen Pellet Erreichen Test, der Zylinder Aufzucht Test und Montoya Treppentest sind die am häufigsten verwendeten Verhaltensbewertungen. Andere in der Literatur beschriebenen Tests sind das Pellet Erreichen Test, Seilprüfung, Ganganalyse und die Klebeband-Test3,17-19. Die meisten von ihnen zeigen eine funktionelle motorische Defizite 1 Woche nach der Verletzung. Gegenwärtig sind die meisten in der Literatur beschriebenen Untersuchungen nur Verhaltenstests durchführen bis zu 42 Tage 4,11,13,20,21, oder für eine kürzere Zeit 3,18,22. Wir haben Verhaltenstests über einen längeren Zeitraum durchgeführt und haben im wesentlichen vollständige Wiederherstellung der motorischen Funktion 8 Wochen nach pyramidotomy für einige der Verhaltenstests gesehen, außer dem Montoya Treppenhaus-Test und der horizontalen Leiter Test. Dies ist vermutlich aus mehreren Gründen. Erstens kann der verletzte CST rostral zur Läsion Synapsen auf Neuronen in Hirnstamm, der als indirekter Relais motorischen Neuronen wirken im Rückenmark zu bilden. Zweitens kann die unverletzten (kontralateral) CST keimen und Formen Synapsen auf Neuronen in Hirnstamm oder das Rückenmark, die als Relais-Motoneuronen handeln. Drittens kann andere verschont motorischen Bahnen wie die retikulospinale, vestibulospinalen oder rubrospinalen Verträge übernehmen irgendeine Funktion. Somit ist eine dauerhafte tEHANDLUNG Effekt ist bei vielen Verhaltenstests im pyramidotomy Modell zu erfassen. Einige Verhaltenstests in diesem Modell jedoch könnte beschleunigte Erholung früh nach der Verletzung, die zu einer Behandlung zusammenhängt anzuzeigen. Flaschenaufzucht Test 3,4,23 Basierend auf dem Zylinder Aufzucht Test der CST, der dem dominierenden Vorderpfote wurde verletzt. Ratten werden in einer Plexiglas-Zylinder hineingelegt und Aufzucht Verhalten wird für einen Zeitraum von 3 min beobachtet. Preinjury gab es eine leichte Präferenz für die Verwendung von einer Vorderpfote, die dominante forepaw, während vertikale Explorations (3A). Die Verletzung wirkt sich auf die dominante Seite und die Verwendung der kontraläsionalen Vorderpfote verringerte sich auf 28% nach 1 Woche nach der Verletzung (ANOVA mit wiederholten Messungen p <0,05; Post-hoc-Analyse zeigte, Tiere haben erhebliche Defizite in Woche 1, 2 und 3, p <0,05, Fisher-LSD). 4 Wochen nach der Verletzung die Tiere wieder eind verwendet den betroffenen Vordergliedmaße 45% der Hinterreifen, und nach 6 Wochen war 57% (n = 16, Mittelwert ± Standardfehler dargestellt). Ähnlich Starkey et al. (4) haben beurteilt Mäusen unter Verwendung des Zylindertest für bis zu 42 Tage nach pyramidotomy und berichtete über eine signifikante Verminderung in der Verwendung des betroffenen forepaw während des gesamten Testzeitraum. Montoya Treppentest 24 Rats erfordern Vortraining für diese Prüfung zu akklimatisieren vor Verletzungen. Um die Motivation während der Testsitzung Tieren erhöht werden Lebensmittel bis 15 g Futter pro Ratte in der Nacht vor beschränkt. Die Nahrung entzogen Ratten werden in der Montoya Treppe für 15 Minuten platziert. Auf jeder Seite gibt es eine Treppe mit 7 Stufen mit Brunnen zu je 3 Pellets. Die Gesamtzahl der abgerufenen Pellets auf jeder Seite aufgezeichnet. Die Anzahl der abgerufenen Pellets mit dem kontraläsionalen / betroffenen Vorderpfote deutlich von 61% auf preinjury3% 3 Tage nach der Verletzung (3B). Die Fähigkeit, Pellets abgerufen wurde noch signifikant nach 4 Wochen nach der Verletzung mit 20% der Pellets abgerufen beeinträchtigt. Ratten zeigen einen signifikanten Defizit bis Woche 8 mit nur 29% der Pellets zu diesem Zeitpunkt gegessen (ANOVA mit wiederholten Messungen p <0.05, Post-hoc-Analyse zeigte, Tiere haben erhebliche Defizite auf der kontraläsionalen Seite jeder Wochen, p <0,05, Fishers LSD). Die ipsilesional Vorderpfote ist bis 1 Woche nach der Verletzung betroffen; aber dies wieder durch die zweite Woche (ANOVA mit wiederholten Messungen p <0.05, Post-hoc-Analyse zeigte, Tiere haben erhebliche Defizite an Tag 3 und Woche 1 am ipsilesional Vorderpfote, p <0,05, Fisher-LSD). Die anfänglichen Defizite der ipsilesional Vorderpfote könnte durch die Läsion des ipsilateralen Teil der Pyramidenbahn durch den Schnitt Pyramide ausgeführt wird, mit anschließender Sprießen und Wiederherstellung erklären. HorizontalLadder-Test 25 Rats erfordern Vortraining für diesen Test. Ratten laufen dreimal über eine 1 m lange Leiter mit unregelmäßigen Sprossenabstand. Videos werden später in Zeitlupe und die Gesamtzahl der Fuß rutscht und Fehlschüsse für jede Pfote analysiert wird quantifiziert. Die Grafik in 3C stellt die Gesamtzahl der Fehlschüsse und rutscht der betroffenen und weniger betroffenen Seite (Vorderpfote + Hinterpfote) als Prozentsatz der Gesamtzahl der zurückgelegten Schritte. Ratten eine signifikant erhöhte Anzahl von Fehler 1 Woche nach der Verletzung mit 10% bzw. 11% auf der betroffenen Seite und weniger betroffenen Seite auf. Dieses Defizit ist persistent auf der kontraläsionalen / betroffenen Seite bis zu 8 Wochen mit 10% Fehler gemacht, jedoch entscheidet über die ipsilesional / weniger betroffenen Seite von 2 Wochen (ANOVA mit wiederholten Messungen, Post-hoc-Analyse zeigte, Tiere haben erhebliche Defizite auf allen Wochen die kontraläsionalen Seite und erhebliche Defizite in Woche 1 und 3 auf der ipsilesionalSeiten, p <0,05, Fisher-LSD). Elektrophysiologische Tests In einem Terminal elektro Aufbau des Tieres wurde intraperitoneal mit Urethan anästhesiert. Während des gesamten Verfahrens wurde es bei 37 ° C ± 1 ° C gehalten. Seine ventralen Halsbereich, seine Vorderbeine und Brustbereich wurden rasiert und mit Jod-Peeling desinfiziert. Die Pyramiden wurden wie zuvor durch einen Bauchansatz Einschneiden der Haut und den großen Brust beschrieben und in den Oberarm der N. radialis ausgesetzt wurde ausgesetzt. Das distale Ende des Radialnerv wurde geschnitten und der Nerv wurde über zwei Silberdrahthaken-Elektroden in einem Mineralölbad gelegt. Entweder Pyramide mit konzentrischen bipolaren Elektroden in verschiedenen Tiefen mit 5 Impulsen bei 300 Hz und zunehmender Stimulationsamplitude stimuliert wird. Die Aufzeichnungen wurden immer von der N. radialis des behinderten Arm (Bild 4) vorgenommen. Unverletzt animals eine starke Reaktion bei Latenzzeiten von 12 bis 20 ms in der N. radialis, wenn die Gegenseite Pyramide wurde angeregt (4B). Ipsilateraler Stimulation führt nur zu gelegentlichen Aktivierung (4C). Tiere, die vorher auf dem Aufzeichnungs Arm empfangen pyramidotomies, auf der kontralateralen Seite zeigen keine Reaktion in Radialnerv bei lädierten Trakt über der Läsion (4B ') stimuliert. Stimulation der CST-Fasern in den Pyramiden ipsilateralen jedoch an die Aufzeichnungselektroden in Folge einer stärkeren Aktivierung in Radialnerv im Vergleich zu unverletzten Tieren nach 12 Wochen nach der Verletzung (4C). Anatomische Ergebnisse. Die Tiere wurden 10 Wochen postoperativ euthanasiert nach Anhang 1 der Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 Zwei Wochen zuvor war die unverletzt CST mit biotinyliertem verfolgenDextran Amin (BDA) Injektionen in den motorischen Kortex 26 ipsilateral zur behinderten Arm (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Quantifizierung von unverletzten Fasern, die über die Mittellinie zu überschreiten und liefern kontraläsionalen Rückenmark (5C, D). Unverletzt Tiere haben nur ein paar Fasern Überqueren der Mittellinie, während dies erhöht in Reaktion auf eine Verletzung. Quer zervikalen Rückenmarkschnitte wurden mit Proteinkinase C (PKC) gamma gefärbt, um den Anteil der Denervierung im läsionierten CST (5E) 16 zu beurteilen. Alternativ kann die Vollständigkeit der Läsion durch Injizieren BDA Tracer in den motorischen Cortex am ipsilesional Seite des pyramidotomy Schädigung bewertet. Das Fehlen der Kennzeichnung in der kontralateralen dorsomedialen CST und die ipsilateralen ventromedialen CST nachweist vollständige einseitige Durchtrennung. <img alt="Figur 1" fo:conte nt-width = "4in" src = "/ files / ftp_upload / 51.843 / 51843fig1highres.jpg" width = "400" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Pyramidenbahn bei der Ratte und einseitige Axotomie der CST in den Pyramiden Bild oben:. Pyramidenneuronen in der Rindenschicht 5 Pyramidenzellen stammen. Biotinylierte Dextran Amin (in grün dargestellt) wird in die kontraläsionelle cortex zwei Wochen vor dem Ende des Experiments injiziert. Mittelbild: Die Verträge bilden die Pyramiden auf der ventralen Oberfläche der Medulla und im spinomedullary Kreuzung die Mehrheit der Axone kreuzen sich. Einseitige pyramidotomy ist im kaudalen Medulla (rot) durchgeführt. Nieder Bild: Der Großteil der Pyramidenbahn, die in den dorsomedialen und dorsolateralen Teile des Rückenmarks führen. Eine Minderheit bleibt ipsilateral und läuft ventromedial. 1843fig2highres.jpg "Breite =" 500 "/> Abbildung 2: Ventralansicht des Rattenhirns. Die Pyramiden sind unverwechselbar, weil sie erhoben werden, parallel Ausbuchtungen (gelber Kasten). Die Grenzen der Pyramiden sind medial von der Arteria basilaris (bas) über die Mittellinie und seitlich an der Basis der Konvexität auf halbem Weg zwischen der Arteria basilaris und paraolivary Arterie (pol), wie in (C) gesehen, definiert. Kraniotomie wird über die Arteria basilaris geführt und seitliche Ausdehnung auf den paraolivary Arterie (rotes Feld in C). Eine Pyramide senkrecht zur Basilararterie geschnitten (rote Linie in C wird geschnitten auf Probe in A und B gezeigt). Läsionen zu kaudal in der Nähe der Wirbelarterien (vert) platziert wird unvollständig sein, da die CST beginnt, kreuzen sich, und weil die A. vertebralis wird von der Mittellinie eingestellt. (C) Bild von George Paxinos 27 von "The Rat Nervensystem" angepasst. HINWEIS: Diese Abbildung zeigt eine Läsion auf der linken Seite des Bildes: Das ist das Tier right Pyramidenbahn, weil er auf dem Rücken liegt. Bitte beachten Sie jedoch, dass das Video zeigt eine Läsion links Pyramidenbahn des Tieres. Abb. 3: Repräsentative Ergebnisse für den Zylinder Aufzucht Test, Montoya Treppe Pellet Erreichen Test und horizontale Leiter Test gibt es eine von allen Tests nach der Verletzung erfassten Motor Defizit. Es kann jedoch keine Defizit mit dem Zylinder Aufzuchttest nach 4 Wochen nach der Verletzung festgestellt werden, während anhaltende Defizite mit dem Montoya Treppenhaus-Test und der horizontalen Leiter Test bis zu 8 Wochen nach der Verletzung (n = 16 pro Gruppe, Mittelwerte und Standardfehler sind erkannt gezeigt). Stern zeigt p <0,05 gegenüber preinjury Basislinie (Fishers LSD-Test). Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Fig. 4: Elektrophysiologie der Beurteilung der Pyramidenbahn vor und nach pyramidotomy (A) zeigt den Aufbau für das Endgerät Experiments. Wir regen die Pyramiden mit einem Zug von 5 Impulse in verschiedenen Tiefen rostral zum Ort der Läsion und Kreuzung. Die rot-Darm-Trakt ist die lädierten Trakt. Wir nehmen aus dem N. radialis auf der kontraläsionalen Seite. (B) und (C) zeigen beispielsweise Aufnahmen mit ipsilesional Stimulation oder kontraläsionalen Stimulation vor und 12 Wochen nach pyramidotomy. Ipsilesional Reize evozieren mehrere Summenaktionspotenziale (Spitzen in der Kurve) in der N. radialis vor Verletzungen (B). Diese werden durch die Verletzung abgeschafft und Tätigkeit nicht return innerhalb von 12 Wochen (B '). Kontraläsionalen Stimulation evoziert seltenen Einzelsummenaktionspotenziale preinjury (C). 12 Wochen nach der Verletzung Aktivität deutlich erhöht (C '), die möglicherweise durch intakte Axone sprießen über die Mittellinie und plastischen Veränderungen im Rückenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Fig. 5: Anatomische Beurteilung nach pyramidotomy (A, B, C, D) Biotinylierte Dextran Amin wurde verwendet, um die Pyramidenbahn durch Injektion in den motorischen Cortex entsprechend dem unverletzten CST verfolgen (siehe in Figur 1 grün). Die dorsalen medialen, die ventralen medialen Komponenten des CST deutlich sichtbar sind (A, dorsalen medialen Teil in B vergrößert). (C) und (D) sind Vergrößerungen von (A) aus Fasern Sprießen über die Mittellinie in der grauen Substanz des denervierten Seite in Reaktion auf eine Behandlung. Um die Vollständigkeit der Läsion Querschnitte der zervikalen Stufe 4 (12 Wochen nach der Verletzung Gewebe) beurteilt wurden geschnitten und mit Antikörpern gegen PKC gamma (E) gefärbt. Das CST auf der linken Seite des Bildes ist intakt und kann gesehen werden prall über die Mittellinie in den denervierten Seite, vermutlich aufgrund der strukturellen Zerfall des verletzten Rücken CST.

Discussion

Wir haben die pyramidotomy Verletzungsmodell beschrieben. Die Pyramidenbahn auf der Höhe des Hirnstamms geschnitten. Aus technischer Sicht ist diese Operation erfordert viel Umsicht und Präzision. Der Hirnstamm nimmt die Atemzentren und die Herz-Kreislauf-Zentren in mehrere Kerne wie den Kern mehrdeutig und solitarii in der Formatio reticularis unter den Pyramiden eingebettet. Wenn der Schnitt gemacht zu tief kann es zu plötzlichen Atembeschwerden, die Lebensgefahr führen. Wir geben Dopram kurz vor dem Schnitt, um die Atmungsaktivität zu erhöhen, um eine plötzliche Atem Einstellung zu verhindern. Wenn der Atemstillstand ist es wert, die Belüftung des Tieres für die folgenden fünf Minuten lang mit Sauerstoff wie es wiederherzustellen. Darüber hinaus sollte eine Beschädigung des Basilararterie unbedingt zu vermeiden. Komplikationen während der ersten Tage nach der Verletzung sind: eine weitere Blutung im Hirnstamm beeinflussen Vitalfunktionen, erheblichen Gewichtsverlust, schwere Atem schwierulties durch umfangreiche Verletzungen, einschließlich der Oliven unmittelbar lateral Pyramiden aufgrund Trachea Verschiebung und starke Ausrichtung und Gleichgewichtsprobleme des Tieres. Diese Komplikationen können so behandelt, als Endpunkte und Tiere auf humane Weise getötet werden. Eine engmaschige Überwachung während der ersten Woche nach der Operation ist von wesentlicher Bedeutung. Ergänzungsfuttermittel können, um Gewichtsverlust auszugleichen erhalten. Entzündung der Atemwege (raue Atmung) in der Regel verschwindet innerhalb von ein bis zwei Tagen. Im Allgemeinen sind jüngeren Tieren einfacher zu bedienen als auf ihren Hals ist weniger tief. Darüber hinaus sind sie widerstandsfähiger und haben weniger Atemkomplikationen.

Es erfordert etwas Übung, um eine komplette Läsion des CST mit einem pyramidotomy erzielen. Auch in zwei Studien, die von Steward et al. 16, die sich daran, ein ehemaliger Experiment Benowitz et al. 28 zu replizieren, berichtete anfänglich hohen Sterblichkeit und dass einige ihrer Läsionen waren unvollständig. VerhaltensDefizite werden auch variabel sein. Es wird empfohlen, eine neue Chirurg führt viele der Praxis pyramidotomy Operationen, bevor eine vollständige Experiment, einen Kandidaten-Therapie zu testen durchgeführt wird. Wegen unvollständiger Läsionen zu verhindern sind Rückverfolgung der Schnitt mit einer Injektionsnadel sicherstellen, dass die Pyramidenfasern in der Nähe der Arteria basilaris durchtrennt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Andere Möglichkeiten sind, um die Läsion mit einem Glas gekippt Saugpipette saugen wie in Zhou et al. 2003 29 beschrieben. Eine feine Wolframdraht kann auch verwendet werden, um den Trakt 22 geschnitten. Eine Alternative zu pyramidotomy ist es, die Gebärmutterhalskrebs C3 dorsale CST einseitig geschnitten und dann mit einem Bauchansatz die ipsilesional C2 ventralen Teil der CST 18 geschnitten. Doch wohl, ist eine komplette Läsion nicht erforderlich, wenn das Ziel ist, Sprießen des kontraläsionalen CST zu studieren; wenn die Mehrzahl der Pyramide läsionierten und einem Austrieb Antwort vom unverletzten Seite geschieht dies ausreichend sein.

Ein Ziel der pyramidotomy Läsionsmodell ist an einer Seite der Pyramidenbahn abzutragen und benutzen neuroplasticity induzierenden Therapien, die Plastizität und Sprossung der intakten nicht verletzten Fasern zu stimulieren. Neuroschütz Therapien getestet dieses Modell ungeeignet und anderen Verletzungen Modelle wie Quetschung Verletzungen verwendet werden soll. Ergebnisse der pyramidotomies werden am häufigsten mit Verhaltenstests und Anatomie bewertet. Die horizontalen Leiter Test, der Zylinder Aufzuchttest und Montoya Treppentest sind die am häufigsten verwendeten Verhaltensprüfungen. Andere in der Literatur beschriebenen Tests sind das Pellet Erreichen Test, Seilprüfung, Ganganalyse und das Klebeband Test 3,17-19. Jedoch sind die Ergebnisse der meisten Verhaltenstest häufig nur bis zu einem Maximum von 42 Tagen nach Läsion 3,4,11,17,18,20-22 überwacht. Aus früheren Erfahrungen, Nagetiere erholen sich die meisten Funktion zu späteren Zeitpunkten ohne Behandlung Intervention. Wir haben gezeigt, that die horizontale Leiter Test und der Montoya Treppe Pellet Erreichen Test erkennt Behinderungen bis zu einem späteren Zeitpunkt. Sie können verwendet werden durch eine Behandlung, um die funktionelle Erholung zu messen. Die Läsion Vollständigkeit wird durch die PKC gamma Anfärbung des Rückenmarks auf rostral zervikalen Pegel oder Eriochrome Cyanin Färbung der Querschnitte der Läsionsstelle (was CST-Fasern in den dorsalen Säulen Etiketten) beurteilt. Biotinylierten Dextran Amin kann in die kontraläsionalen Kortex eingespritzt werden, um die Keimung der intakten Fasern über die Mittellinie in den denervierten Rückenmarksbereich zu bewerten.

Zusammenfassend ist die pyramidotomy Modell gut zur Beurteilung Neuroplastizität auslösenden Fähigkeiten einer Behandlung Droge für das zentrale Nervensystem Verletzungen, wenn die Operation erfolgreich gemeistert wird. Er beurteilt die Plastizität von intakten Fasern. Der nächste Schritt wäre, eine weitere klinisch relevanten Modell, wie Quetschungen Verletzungen zu verwenden, um das Medikament die Fähigkeit, größere SCHADEN überwinden bewertenes, die mehrere Verträge.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der International Spinal Research Trust und die Treuhand Rosetrees unterstützt.

Materials

Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 5mg/kg twice daily
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Isoflurane Abbott B506
Fine Scissors- Tough Cut Fine Science Tools 14058-09
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Long-toothed Alm retractors Fine Science Tools 17009-07
cautery system kit Harvard Instruments 726067
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Carbon Steel burrs Fine Science Tools 19007-07
Dopram V-drops Pfizer apply 1 drop to tongue
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
gelfoam Equimedical EQU705001
3-0 Vicryl sutures Ethicon
operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Scales Ohaus NVT3201
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25g needles Terumo NN-2525R
syringes (1ml and 5ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
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Referenzen

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Kathe, C., Hutson, T. H., Chen, Q., Shine, H. D., McMahon, S. B., Moon, L. D. F. Unilateral Pyramidotomy of the Corticospinal Tract in Rats for Assessment of Neuroplasticity-inducing Therapies. J. Vis. Exp. (94), e51843, doi:10.3791/51843 (2014).
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