시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

이 방법에 대한 훌륭한 테스트 기판은 헥소 키나제이다. 이는 용이하게 시판되고, 대부분의 실험실에서 발견 및 분석에서 분명, 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 두 기판을 갖는 장점이있다. 초기 농도 화면 (1 프로토콜), 헥소 키나제 및 글루코오스 (도 2A)를 사용하여, 예상 K (D)이 0.2 mm 내지 1.7 범위 일 것이라고 제시한다. 따라서, 큰 화면 (프로토콜 2) 표 4의 결과 (그림 2B)에 표시된 농도를 사용하여 수행 된 단일 사이트 리간드 결합 식에 잘 맞는 표시 (프로토콜 부분 3.3) [9]을 준 K 1.2 ± 0.1 mm의 D. 추정 heptose-guanyl 전이 WcbM (19, 20)는 GTP (그림 3A)에 결합에 강한 열 변화를 보여줍니다. 초기 화면이 제안하는 KD는 약 100 μM의 범위에있을 것이다. . 따라서, 전체 화면이 3.3 수학 식 결과 피팅 표 5에 나타내는 농도를 사용하여, 설정 합리적인 착용감 (0.981의 R 2,도 3B) 보였다 .however를을, 데이터 사이의 명백한 차이가있다 모델, 상이한 방정식이 필요하다는 것을 시사한다. WcbM 서열과 단백질 데이터 뱅크 (21)의 검색은 구조 양식 이량 체를 결정되었습니다있는 가장 가까운 상동 것으로 나타났다. 따라서 데이터는, 순차 협동하고 두 리간드 (4 프로토콜)의 독립적 인 결합을 위해 세 개의 방정식을 사용하여 분석 하였다. 순차적이고 독립적 바인딩 모델 모두 0.992의 R 2 값 0.480와 0.461의 Sy.x을 준 반면 협력 모델의 피팅 통계, R이 0.998의 가치와 0.215의 잔차 (Sy.x)의 표준 편차를 준 각각. 이 모델 제안협력 모델은 데이터에 가장 적합한되었다 제공 : 여기, 230 ± 10 μM의 K ½이 관찰되었다, 0.52 ± 0.02 (그림 3C)의 n 값으로. 이 바인딩에 부정적인 협동성을 지적했다. K!에 대한 단위가 좀 불충분 μM 0.52 것 같은 K ½이, 오히려 K (d)보다이 경우에 사용합니다. 추정 GDP-6-데 옥시-β-D-는 manno -heptopyranose 2 -acetylase O, WcbI (22)는 시차 주사 fluorimetry에서 다소 특이한 결과를 보여줍니다. 모든 리간드의 부재에서, 간단 명료 한 변성 (도 4a)를 도시한다. 프로토콜에 설명 된 코엔자임 A (CoA를가) DSF를 사용하여이 단백질의 리간드,이 파트너 단백질의 친 화성이 확인되었다 조사 하였다. CoA를 고농도, 강한 (S)의 존재하에높은 온도로 hift 15 °의 C의 용융 온도에 변화가 관찰된다. 그러나, 중간 농도에서 오히려 중간 용융 온도에서 단상 녹는 시프트보다 WcbI는 단백질 리간드없는 온도, 또는 완전히 구속 용융 온도 (도 4a) 중 하나에 녹아 나오는 상을 가진 용융 나타났다 . 더 높은 온도 (도 4b)에서 용융 비율을 증가 기질 농도가 증가함에 따라, 용량 의존적으로 변경이 종의 비율. 이러한 데이터를 직접 분석은 도전이었다 파생 방법이 녹는 이벤트가 발생하였으나, 증가 리간드 농도 변화를 보여주는 데 도움이되지 않았 음을 강조하면서 볼츠만 방정식에 피팅하는 것은 매우 가난한 맞는을 주었다. 이들 데이터를 분석하기위한 통상적 인 방법은 덜 따라서 (프로토콜 5)를 채택 하였다. 형광 D리간드없이 높은 리간드 농도 erivati​​ve 결과는 본질적으로 더 낮은 용융 온도의 모든 단백질, 또는 높은 용융 온도를 나타내는 상태로 촬영 하였다. 나머지 데이터는 화합 유도체 (도 4C)에 합산 비율,이 두 가지 상태의 각각의 비율의 합계로서 각 시점에서 장착되었다. 수득 된 데이터는 이전과 같은 방정식을 이용하여, 겉보기 K d를 구하는 전으로 장착 하였다. 이 "높은"리간드 점은 95 %의 리간드가 결합 될 가능성이 있음을 강조했다. 데이터는 100 % 단백질 결합의 결과를 외삽 예측하고, 데이터는 58 ± 2 μM의 겉보기 K d를주고 반복 피팅. 이 바인딩 모델 (그림 4D)에 실험 결과의 우수한 착용감을 제공했다. <img alt="그림 1" fo : 콘텐츠 너비 = "5 인치"src = "/ 파일 / ftp_upload / 51,809 / 51809fig1highres.jpg""500"> 실험 설정 및 분석의 1 예를 그림. (A) 열 변성 프로파일의 예상 된 형상의 예 (효모 헥소 키나제에 대한 데이터에서 촬영). 원시 데이터의 특징 형상은 얕은 감소 하였다 최대 형광 프로그레시브 상승 (도 9에서보다 상세하게 논의)를 나타낸다. 이것은 형광의 1 차 도함수에서 단일 피크를 동반한다.을 Graphpad로 데이터 입력 (B) 실시 예. 리간드 농도는 X 축에 주어지고, Y 축에 용융 온도를 관찰한다.을 Graphpad 수학 식 정의의 (C) 실시 예. (D) 예를 정확하게 및 단백질 농도의 고정 변수의 초기 값을 설정하는, 해리 상수의 올바른 판정을 활성화합니다.m / 파일 / ftp_upload / 51,809 / 51809fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. . 시차 주사 fluorimetry 의해 측정 글루코스 헥소 키나제의도 2의 상호 작용 (A) 글루코스 농도의 광범위한 테스트 초기 실험은 K (D)가 0.2의 범위에있을 가능성이 있음을 시사 -. 1.7 mM의 (B) 상세한 실험, 포도당의 16 농도를 테스트, 1.12 ± 0.05 밀리미터로 명백한 K (D)의 결정을 할 수 있습니다. 데이터는 (35.4 ± 0.2 ºC 및 49.3 ± 0.5 ºC 각각 피팅 바닥 (T1)와 최고 (T2) 온도가) 하나의 바인딩 이벤트에 대한 모델에 매우 잘 맞는다. 그 주이들 데이터는 10 mM의 MgCl2를 존재 하에서 수집 하였다. 이러한 이미지는 그래프 패드를 사용하여 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. GTP와 WcbM의 그림 3의 상호 작용은 방지 협력 바인딩을 알 수있다. (A) GTP 농도의 광범위한 테스트 초기 실험은 K (D)가 (200)의 범위에있을 가능성이 있음을 시사 -. 500 μM GTP 16 농도를 시험 (B) 상세한 실험은, 겉보기에 대한 값을 제안 120 ± 20 μM의 K d를. 그러나, 로그 스케일은 X-축에 사용되는 경우, 상당한 discre 거기모델 데이터 사이의 입주는. 협력 모델과 같은 데이터 (C) 분석은 단순한 협력 모델을 사용하는 데이터에 대한 우수한 착용감을 보여준다. 여기서, K 230 ± 20 μM의 ½은 (각각 69.63 ± 0.06 ºC 및 79.9 ± 0.1 ºC에 피팅 바닥 (T1)와 최고 (T2) 기온) 협동성 계수 N = 0.52 ± 0.02로 결정되었다. WcbM이 이량 것으로 보인다,이 효소는이 GTP에 결합에 완벽하게 anticooperative 것을 의미한다. 이러한 이미지는 그래프 패드를 사용하여 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4 WcbI는 이상성 녹는 패턴을 보여줍니다그 리간드 보효소 A (COA)의 존재. (A) WcbI은, 리간드 (청색)의 부재하에, 간단한 단상 융점 패턴을 나타낸다. 높은 리간드 농도 (1 ㎜, 녹색 라인)에서, 유사한 패턴이 관찰된다. 그러나, 중간 리간드 농도. (60 μM; 적색 선)이 뚜렷한 융점 피크는, 리간드 – 자유 리간드 – 결합 상태에 대응하는 관찰된다 (B)의 피크의 두 세트 사이의 천이는 용량 의존적 전체 건너편 농도의 범위는. 리간드 무료 높은 리간드 결과의 비율의 합으로 2 상 용융 (C) 모델링은 (빨간 선에 비해 점선 보라색 선) 데이터에 잘 맞는을 제공합니다. 이 적합 전체 인원 (파란색 파선)에 (모델이 제안 ~ 95 % 점유율)이 높은 리간드 농도에 대한 관찰 결과를 외삽에 의해 향상된다. (D) CoA를 소에 바인딩 WcbI의 비율 얻은 데이터를 WS 58 ± 2 μM의 K D 포함 간단한 결합 모델에 우수한 착용감 (이러한 데이터 결과들의 제 1 세트에 기초하여 제 2 일에 대해 선택된 약간 다른 리간드 농도로, 두 개의 분리 된 일에 수집 된 데이터를 표시). 패널. -을 Graphpad를 사용하여 (C) Excel을 사용하여 제조하고, 패널 (D) 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 초기 실험 표 1 레시피. 시약 믹스 볼륨 (μL) 단백질 0.11 ㎎ / ㎖의 최종 농도 ; "> 5000X SYPRO 오렌지 0.3 0.5 M HEPES pH를 7.0 3.7 5 M NaCl을 5.6 물 180 μL에 이것은 프로토콜 부 (1)이 버퍼 혼합물 일반 단백질 적합한에서 설명한 바와 같이, K (D)의 추정치를 제공하기 위해 초기 정찰 실험 단백질, 검출 시약 및 버퍼의 "마스터 믹스"를 설명한다. 이전의 결과는 다른 버퍼 표기 제안 여기서, 이들은 치환한다. 단백질 재고가 낮은 농도 (즉, 0.3 미만 ㎎ / ㎖)에있을 경우, 추가 버퍼의 양을 감소시킬 필요가있을 수도 단백질 샘플 버퍼에 이미 존재를 보상하기 위해 추가. <p클래스 = "jove_content"> K (D)의 결정을위한 표 2 레시피. 시약 믹스 볼륨 (μL) 단백질 0.11 ㎎ / ㎖의 최종 농도 5,000 배 SYPRO 오렌지 1.78 0.5 M HEPES pH를 7.0 22.2 5 M NaCl을 33.3 물 180 μL에 이는 단백질, 검출 시약, 및 (b)의 "마스터 믹스"를 설명uffer는 단백질 샘플에 대한 K (D)의 전체 측정을 위해, 프로토콜 부 (2)에 설명 된대로이 버퍼 혼합물은 일반 단백질에 적합합니다. 이전의 결과는 다른 버퍼 표기 제안 여기서, 이들은 치환한다. 단백질 재고가 낮은 농도 (즉, 0.3 미만 ㎎ / ㎖)에있을 경우, 추가 버퍼의 양을 감소시킬 필요가있을 수도 단백질 샘플 버퍼에 이미 존재를 보상하기 위해 추가. 표 3 식 및 데이터 분석을위한 파라미터. 실험 프로토콜의 단계 식 요구 매개 변수가 필요 변수 및 매개 변수에 대한 설명 3.3 </TD> 바인딩 단일 사이트 리간드 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * (1 – ((PK D – X +의 SQRT (((P + X + K d를) ^ 2) – (4 * P * X))) / (2 * P )))) P : 단백질 농도. KD : 해리 정수. P 말하고 Td는 리간드 농도에 사용 된 동일한 단위로 제공됩니다. 위쪽, 아래쪽 : 무한 리간드 농도와 각각 어떤 리간드 농도에서 녹는 온도. 3.4 바닥 = * YMIN YMIN : (이 경우 낮은 실험 단백질 TM) Y의 최소값 최고 = * Ymax 순 </td> Ymax 순 : Y의 최대 값 (가장 높은 실험 단백질 TM) K의 D = * X YMID에서 YMID : YMIN 및 Ymax 순의 평균에 해당하는 Y의 값입니다. X는 (여기서, 중요한 리간드 농도) 대응하는 X 값이고 P = (초기 값, 적합 할 수) 4.1 단순 협력 모델 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * (((X / Kd를) ^ N) / (1 + ((X / Kd를) ^ N)))) N : H아픈 계수. 이는 단백질의 협동성 또는 기타 생화학 적 특성을 설명하고, 반드시 단백질 리간드 결합 부위의 수를 추정하지 않다. 하나의 언덕 계수는 협동성을 나타내는 없습니다 보다 낮은 값은 음의 협동성을 표시하고보다 큰 양의 협동성 값. 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 P = (초기 값, 적합 할 수 있습니다 ) N = (초기 값, 적합 할 수) 이 리간드의 결합 순차 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2)) / (1 ​​+ (X / K의 D) + ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2))) ) K2 : 초 바인딩 이벤트에 대한 해리 정수. 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 DTH : 123px; "> K의 D = * X YMID에서 YMID에서 K2 = * X P = (초기 값, 적합 할 수) 독립이 리간드의 결합 Y = 하단 + ((상위 – 하위) * ((X ^ 2) / (K d 개 *의 K2)) / (1 ​​+ (2 * X / K의 D) + ((X ^ 2) / (K D의 * K2) ))) 바닥 = * YMIN 시간 : 123px; "> 인기 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 YMID에서 K2 = * X P = (초기 값, 적합 할 수) 5.5 융점 이진 시프트 분석 Y = 1 – ((PK-X + D의 SQRT (((P + X + K D) ^ 2) – (4 * P * X))) / (2 * P의)) 23px; "> 바닥 = * YMIN 최고 = * Ymax 순 K의 D = * X YMID에서 P = (초기 값, 적합 할 수) 5.8 무한 리간드 농도로 외삽 (C2 – ((1 $ R 2달러) * B2)) / $ R 2달러 B2 : 없음 리간드 결과를 포함하는 세포. C2 : 최대 리간드 결과를 포함하는 세포. $ R 2달러 : 최대 농도로 리간드 바인딩 비율로 함유 세포. 4, 3 단계 및 (5)는 분석 소프트웨어로 상세한 방정식 외에, 데이터 분석을위한 매개 변수를 개시 정확한 정의를 필요로한다. 각각의 중요한 단계를위한 방정식은 파라미터의 정확한 선택에 도시된다. 변수와 파라미터의 의미를 설명은 참조 용으로 제공된다. 표 포도당 헥소 키나제의 상호 작용의 스크리닝 (4) 농도. 샘플 포인트 리간드 (glucosE)의 농도 (㎜) 1 0 이 0.001 3 0.005 4 0.01 5 0.03 6 0.1 7 0.3 8 0.4 9 0.7 10 1.1 11 2.1 12 3.7 13 5.3 14 7 15 9 16 11 프로토콜에 기술 된 바와 같이 마그네슘 공지 보조 인자이기 때문에 신진 효모 사카로 미세스 세 레비 시아에로부터 헥소 키나제는 10 mM의 MgCl2를 보충, 마스터 믹스에 첨가 하였다. K (D)의 초기 추정치는 0.5와 2 mM의 사이에 있었다. 실험은 글루코스 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 설정되었다. 표 GDP와 WcbM의 상호 작용의 선별 5 농도. <table border="1" cellpadding= "0"cellspacing = "0"> 샘플 포인트 리간드 (GTP) 농도 (μM) 1 0 이 0.5 3 1 4 5 5 10 6 25 7 50 8 100 9 250 10 8px; "> 500 11 1000 12 2500 13 5000 14 7500 15 10000 16 20000 프로토콜에 설명 된대로 부르크 홀데 pseudomallei부터 WcbM 마스터 믹스에 첨가 하였다. K (D)의 초기 추정치는 약 100 μM이었다. 실험은 상기와 K D의 크기보다 적어도 두 개의 명령을 포함하는 것을 목표로, GTP의 표시된 최종 농도를 제공하기 위해 설정되었다.