Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

No início do desenvolvimento das células T, de medula óssea hematopoiéticas derivadas de células progenitoras pluripotentes são recrutados para o córtex do timo, submetido a compromisso de linhagem T e tornar-se precursores de células T ^1. No córtex, precursoras de células T CD4 e CD8 duplo negativos (DN) timócitos expandir e diferenciar em imaturo CD4 e CD8 duplo positivo (DP) timócitos, formando uma grande piscina de progenitores com receptores de células T altamente variável ^1. Apenas um seleto subconjunto MHC-restrito de células DP vai se tornar único positivos (SP) timócitos CD4 ou CD8, migram para a medula do timo, e se diferenciar em células T maduras funcionalmente competentes, um evento que é chamado de seleção como positiva ^{2 6.} Em contraste, os clones de timócitos auto-reactivos sofrem de selecção negativa e são removidos por meio de apoptose, convertidas em células T reguladoras para a auto-tolerância, ou desviado para linfócitos intra-epiteliais para fins que ainda não são claras ^3,7-10.

No timo, as células do estroma de timo formar um microambiente único fornecimento de sinais para esses vários destinos de desenvolvimento de células T ^5,11,12. As células do estroma de timo são compostas por células epiteliais tímicas (TEC) – incluindo TEC corticais (CTECs TEC) e medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, pericitos derivados da crista neural e outras células mesenquimais ^13-15. Entre estes, TEC são cruciais nas várias fases de desenvolvimento das células T ^1,2,16,17. No entanto, a falta de uma forma robusta para isolar TEC tem dificultado uma compreensão abrangente de suas funções ^16. Em particular, CTECs, que formam uma rede tridimensional circundante progenitores no córtex, são essenciais para a seleção positiva ^13,18,19 por razões que ainda não estão claras. Estudos anteriores forneceram pistas sobre a heterogeneidade eo papel da TEC, principalmente contando com ferramentas morfológicas e histológicas ¹³ </sup>. Recentemente, os papéis únicos de subconjuntos TEC foram abordados por abordagens genéticas em modelos de ratos ^12,20. A forma robusta e reproduzível para isolar TEC é fundamental para alcançar a caracterização imparcial de subconjuntos do TCE, avaliação quantitativa e qualitativa das funções do TCE, e esclarecimento de mecanismos como CTECs apoiar seleção positiva.

Devido à raridade da TEC no timo e as interações apertadas formam no órgão intacto, o isolamento da TEC tem sido um desafio. O protocolo aqui descrito é baseado em descobertas anteriores, atualmente reagentes disponíveis, técnicas e conhecimento da estrutura do timo e composição estromal. Há quase duas décadas, vários procedimentos foram relatados desagregar tecidos timo ^21-27, em que diferentes enzimas foram utilizadas durante a digestão, incluindo tripsina, colagenase e Dispase. Gray et al. comparação dessas enzimas em sua precedure ^28, e relataram uma melhoria da method com a digestão de várias etapas de coquetéis enzimáticos ²⁹ que se tornaram amplamente utilizados ^20,30. No entanto, este método envolve um tempo de preparação longos e complexos processos de digestão e resulta em última variável o número de células e as proporções de TEC ainda na mesma coorte de murino ^29,30. Vários anos atrás, Liberase enzima grau de investigação, contendo altamente purificado colagenase e protease neutra começou a ser utilizado na dissociação tecido do timo ^30. Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em digestão Liberase, com processos de separação mecânica optimizadas, que produz um elevado número de TEC viáveis ​​a partir de tecidos do timo do rato. .

Para enriquecer células estromais dissociados, estudos anteriores têm usado gradientes de densidade ou separação magnética talão ^21,29. No entanto, ambos os métodos de causar grave perda de determinadas populações de células do estroma de timo, especialmente a população de CTECs ^29. Eliminação citotóxica e técnicas de panning <sse> 31,32 têm sido amplamente utilizadas para a depleção ou separação de linfócitos no campo imunológica ^12,31. Após a comparação destas técnicas, foi estabelecido o protocolo de panning atual para o enriquecimento da TEC. A condição suave durante o processo de enriquecimento leva a menos morte celular e imparcial e uma maior recuperação do TCE.

A suspensão de células do timo isolado descrito na Seção 3 pode ser aplicado diretamente para análise por citometria de fluxo para a identificação e caracterização dos subconjuntos TEC e células dendríticas. A Seção 4 descreve uma forma simples e útil para identificar subconjuntos TEC utilizando fluxo multiparâmetro citômetro. Para experiências que procuram obter CTECs purificadas ou mTECs, TEC enriquecimento e células de triagem procedimentos podem ser encontradas na Seção 5 e 6.