El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Temprano en el desarrollo de células T, la médula ósea madre hematopoyéticas progenitoras multipotentes derivadas de células son reclutados a la corteza del timo, someterse compromiso de linaje T y se convierten en precursores de células T ^1. En la corteza, precursores de células T CD4 y CD8 doble negativos (DN) timocitos se expanden y se diferencian en células CD8 doble positiva (DP) timocitos inmaduros CD4 y, formando un gran grupo de progenitores con receptores de células T altamente variable ^1. Sólo un selecto subconjunto restringido por MHC de las células DP se convertirá en único positivos (SP) timocitos CD4 o CD8, migran a la médula del timo, y se diferencian en células T maduras funcionalmente competentes, un evento que se conoce como selección positiva ^{2 6.} En contraste, los clones de los timocitos autorreactivos se someten a selección negativa y se eliminan a través de la apoptosis, convertido a las células T reguladoras para la auto-tolerancia, o desviado a los linfocitos intraepiteliales para los propósitos que aún no están claras ^3,7-10.

En el timo, las células estromales tímicas forman un microambiente único que proporciona señales para estos diversos destinos de desarrollo de células T ^5,11,12. Células del estroma tímico se componen de células epiteliales del timo (TEC) – incluyendo TEC corticales (CTEC) y TEC medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, pericitos derivadas de la cresta neural y otras células mesenquimales ^13-15. Entre estos, TEC son cruciales en las diversas etapas de desarrollo de células T ^1,2,16,17. Sin embargo, la falta de una manera robusta para aislar TEC ha obstaculizado una comprensión global de sus funciones ^16. En particular, CTEC, que forman una red tridimensional que rodea a los progenitores en la corteza, son esenciales para la selección positiva ^13,18,19 por razones que aún no están claras. Estudios anteriores proporcionaron pistas sobre la heterogeneidad y el papel de los TEC, sobre todo contando con herramientas morfológicas e histológicas ¹³ </sup>. Recientemente las funciones únicas de subconjuntos TEC fueron abordados por enfoques genéticos en modelos de ratón ^12,20. Una manera robusta y reproducible para aislar TEC es fundamental para lograr la caracterización objetiva de subconjuntos TEC, la evaluación cuantitativa y cualitativa de las funciones TEC, y la aclaración de los mecanismos de cómo CTEC apoyan la selección positiva.

Debido a la rareza de TEC en el timo y las interacciones apretados forman en el órgano intacto, el aislamiento de TEC ha sido desafiante. El protocolo descrito aquí se basa en descubrimientos anteriores, actualmente reactivos disponibles, las técnicas y el conocimiento de la estructura y composición del estroma del timo. Hace casi dos décadas, se reportaron varios procedimientos para desagregar los tejidos del timo ^21-27, en el que se utilizaron diferentes enzimas durante la digestión, incluyendo tripsina, colagenasa y dispasa. Gray et al. comparado esas enzimas en su precedure ^28, e informó de una mejora de la metanfetaminaod con la digestión de múltiples pasos de cócteles enzimáticos ²⁹ que se hicieron ampliamente utilizado ^20,30. Sin embargo, este método implica un largo tiempo de preparación y los pasos y los resultados de digestión complejos en el número de células y proporciones de TEC última variable, incluso en la misma cohorte murino ^29,30. Hace varios años, Liberase enzima grado de investigación, con adición altamente purificada de colagenasa y proteasa neutra se empezó a utilizar en la disociación del tejido del timo ^30. A continuación, describimos un protocolo basado en la digestión-Liberase, con procedimientos de separación mecánica optimizados, que produce un alto número de TEC viables a partir de tejidos de timo de ratón. .

Para enriquecer las células del estroma disociadas, estudios previos han utilizado tanto los gradientes de densidad o la separación de cuentas magnéticas ^21,29. Sin embargo, ambos métodos causan severa perdida de ciertas poblaciones de células del estroma del timo, en particular la población de CTEC ^29. Eliminación citotóxica y técnicas de paneo <shasta> 31,32 han sido ampliamente utilizados para el agotamiento o la separación de los linfocitos en el campo inmunológico ^12,31. Después de la comparación de estas técnicas, hemos establecido el protocolo actual de panoramización para el enriquecimiento de TEC. La condición suave durante el procedimiento de enriquecimiento conduce a una menor muerte celular e imparcial y una mayor recuperación de TEC.

La suspensión de células aisladas del timo se describe en la Sección 3 se puede aplicar directamente a análisis citométrico de flujo para la identificación y caracterización de subconjuntos TEC y células dendríticas. Sección 4 describe una forma sencilla y útil para identificar subconjuntos TEC utilizando citómetro de flujo multiparamétrica. Para los experimentos que buscan obtener CTEC purificados o mTECs, enriquecimiento TEC y clasificación de células procedimientos se pueden encontrar en la sección 5 y 6.