Une procédure de petit volume pour la concentration virale de l'eau
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
Les virus entériques humains sont importants agents responsables de maladies d'origine hydrique 1-3, mais sont généralement présents en faible nombre dans les eaux environnementales contaminées, ce qui rend leur détection difficile sans concentration. Les procédures utilisées pour concentrer les virus comprennent généralement une étape de filtration, suivie d'une élution filtre et secondaire concentration de l'éluat de filtration. Une procédure de filtration commune se fonde sur l'utilisation de membranes chargées telles que des filtres électropositifs (récemment examinés dans 4,5). Ces filtres reposent sur la capture des virus en suspension dans l'eau en utilisant des interactions électrostatiques entre la surface de filtre (chargé positivement) et les particules virales ciblées (chargés négativement). Deux filtres électropositifs qui sont disponibles dans le commerce se appuient sur cette technologie, les filtres en verre / cellulose nano-alumine et / fibres de verre. Les coûts de filtrage verre / cellulose sont jusqu'à 10 fois celle de la / fibres de verre nano-alumine, ce qui limite l'utilisation du verre / cellulose filtres pour la surveillance du virus de routine. Des études récentes ont conclu différences sont nominales entre ces deux filtres dans la récupération des entérovirus de 6,7 de l'eau ambiante, ce qui justifie l'utilisation d'une alternative de filtre moins cher. Autres options de filtres tels que les filtres électronégatifs et de laine de verre ont été étudiés, cependant, ils nécessitent soit le prétraitement de l'eau de source (filtres électronégatifs) ou ne sont pas disponibles dans le commerce (filtres de laine de verre). L'élaboration de procédures de concentration de virus a surtout mis l'accent sur l'optimisation des techniques de concentration primaires (filtres) afin d'améliorer la récupération de virus de l'eau. Toutefois, les procédures de concentration secondaires, qui réduisent le volume d'éluant typiquement de 1 L à millilitre volumes, peuvent également avoir un impact significatif sur les recouvrements de virus 8.
Concentration secondaire des virus entériques repose généralement sur un agent de floculation tels que certains types de l'extrait de boeuf (floccu organiquement) ou le lait écrémé floculation 12/09 pour éliminer les particules virales à partir des surfaces de filtrage. Récemment, une autre procédure de concentration secondaire en utilisant l'extrait de boeuf couplé avec l'ajout de célite (particules fines) a montré des résultats prometteurs pour la récupération de l'adénovirus, entérovirus, norovirus et 8,13,14. Celite travaux de concentration en vertu des principes similaires à ceux du procédé de floculation organique en ce que des particules de virus se attachent et sont libérés à partir de particules (floculation ou la célite) en modifiant le pH de la solution de suspension. Les comparaisons entre ces deux techniques de concentration secondaires ont été évalués dans la récupération des adénovirus pointes (adv) types 40 et 41 8. Cette étude a conclu que les deux techniques de concentration secondaires étaient statistiquement similaires dans la récupération des adénovirus. Cependant, le procédé de floculation organique nécessite une 30 min. incubation à un pH de 3,5, tandis que la technique de célite nécessite une incubation plus court (10 min) à un pH de 4,0. Le flocculat organiqueion nécessite également l'utilisation d'équipement de laboratoire coûteux (des centrifugeuses) pour recueillir des particules de floc pendant concentration tertiaire, la technique de la celite en revanche ne utilise que des équipements de laboratoire de base (filtration sous vide) pour séparer les particules de la suspension de célite.
Certaines combinaisons de filtres et de techniques d'élution secondaires peuvent également affecter récupérations de virus. Une étude a conclu que certaines combinaisons de primaires (filtres électropositifs) et des techniques de concentration secondaires (célite ou floculation organique) ont eu un impact significatif de la reprise de l'adénovirus 13. Ces résultats suggèrent que l'optimisation est nécessaire pour récupérer le virus de la cible de manière optimale à partir d'une matrice d'eau donnée pour l'utilisation de ces techniques. L'optimisation est beaucoup de temps, processus ardu de nombreux chercheurs évitent activement depuis de nombreuses variables seront évaluées (type de filtre / marque, solution d'élution de pH, célite / floculation organique).
Pour ce sTudy, une procédure a été développée pour identifier les conditions optimales pour la concentration du virus dans l'eau en utilisant l'adénovirus humain pointes souches 40 et 41. On peut supposer que, puisque chaque type de virus affiche une morphologie de capside unique et frais de capside spécifique, peuvent avoir besoin d'être optimisé pour tous les virus protocoles de concentration cibler pour parvenir à une reprise virale optimale. Cette étude fournit une approche pour 40 AdV et 41 concentration par: 1) l'évaluation de récupérations de virus dans l'eau du robinet en utilisant des disques de filtres électropositifs suivis par 2) l'évaluation d'une méthode de floculation organique établie par rapport à la technique de célite comme une concentration secondaire, et 3) l'évaluation des tampons d'élution pour la concentration tertiaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Filtres électropositifs sont utiles à concentrer virus de l'eau; Cependant, ces filtres peuvent différer dans leur structure et la composition qui pourrait à son tour modifier leur efficacité. Se ajoute à ce problème, les structures et les charges varient capside entre les souches de virus nécessitant des techniques de concentration être adaptés pour assurer une récupération optimale 15. Grâce à des modifications simples des techniques de concentration existants (par exemple, filtre…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
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