Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

1. Instrument Settings / Preparación de los reactivos / Genotipado Preparar medio de células iPS: Suplemento 500 ml Knockout medio DMEM con suero de 75 ml fetal bovino (FBS), 5 ml de L-glutamina, 5 ml aminoácidos no esenciales, 500 l β-mercaptoetanol, 5 x 10 5 unidades de factor inhibidor de la leucemia ( LIF). Por favor, consulte la Lista de Materiales para el producto e información de compras para los reactivos utilizados en el contexto de este manuscrito. Preparar medio MEF: Suplemento de 500 ml DMEM con 50 ml de FBS, 5 ml de L-glutamina, 5 ml Los aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 5 ml, 500 l β-mercaptoetanol. Preparar medio de congelación: Por 10 ml, combine 9 ml de FBS con 1 ml de DMSO. Preparar platos recubiertos con gelatina, añadir la solución de gelatina porcina 3-5 ml 0,1% a un matraz T75, se incuban a temperatura ambiente durante al menos 10 min y aspirar justo antes de su uso. Preparar medio de marcaje FACS: para 10 ml, mezclar 9,9 ml de PBS con 0,1 ml de FBS. Realiceuna PCR genotipo para el locus Rosa26 m2rtTA: Realizar reacciones con Taq ADN polimerasa según las instrucciones del fabricante. Use un modificado MgCl2 -concentración de 3,5 mM y las siguientes 3 ​​cebadores: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG TGT AGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA GAT ATG ATG 3 '. Ciclismo condiciones: 94 ° C durante 3 min; 35 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 65 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 2 minutos; mantener a 12 ° C. Tamaño del producto esperado: 650 pb para el alelo de tipo salvaje y de 340 pb para el alelo mutante. Lleve a cabo una PCR genotipificación para el locus colágeno-StemCa / OKSM: Realizar reacciones con Taq ADN polimerasa según las instrucciones. Use un modificado MgCl2 -concentración de 2,5 mM y las siguientes 3 ​​cebadores: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condiciones de los ciclos: 95 ° C durante 1 min: 2 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 70 ° C durante 45 s), 6 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 45 segundos) y 30 ciclos de (94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 5 minutos; mantener a 12 ° C. Tamaño del producto esperado: 331 pb para el alelo de tipo salvaje y 551 pb para el alelo mutante. Llevar a cabo todos los pasos de centrifugación a 400 xg durante 3 min a 4 ° C. 2. Generación de fibroblastos embrionarios de ratón Realizar un apareamiento sincronizado entre un animal de la cepa OKSM con un miembro del sexo opuesto de la cepa m2rtTA. Cosecha embriones en el día embrionario 13,5 por sacrificio de la madre y de la eliminación de la trompa uterina. Antes de la retirada del cuerno uterino, rocíe la región abdominal con una solución de etanol al 80%, para evitar la contaminación microbiana. Transferir el cuerno uterino en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm que contenía 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Utilice tijeras quirúrgicas de grado esterilizados para cortar el cuerno uterino en trozos que contienen un embrión (véase la Figura 3A, B). Utilice un microscopio de disección (idealmente colocado dentro de una campana de cultivo de tejidos) y pinzas esterilizadas para quitar cuidadosamente la envoltura del útero y las membranas extra-embrionarias que rodean a cada embrión. Transferir cada embrión a un 10 cm separada plato con 10 ml de PBS. Proceder mediante la eliminación de la cabeza del embrión, las extremidades, la cola y los órganos internos (corazón, hígado, intestino, etc) con las pinzas (véase la Figura 3C). Transferencia de la cabeza del embrión en un tubo de 1,5 ml y congelar hacia abajo de modo que puede ser utilizado para el genotipado si es necesario. Transferir el torso del embrión en un 10cm plato vacío y utilizar dos hojas quirúrgicas para picar el embrión durante 2 min. Añadir 200 l de solución de tripsina / EDTA en la parte superior del embrión picada y se incuba durante 3-5 min a TA. Continuar picado durante 2 min, añadir 2 ml de medio MEF en activar la tripsina, y luego transferir a un tubo de 15 ml. Utilice una pipeta de 1.000 l para disociar más mecánicamente el tejido mediante pipeteo suave. Transferencia a una gelatina recubierto placa de 10 cm y añadir otros 10 ml de medio MEF. Nota: Las dos incubadoras normoxic hipóxica y pueden ser utilizados para la cultura, se refieren a la discusión para más información. Después de 24 a 48 horas, la placa debe ser densamente cubierto con MEFs. Alternativamente, las células pueden propagarse a continuación, o se congelan aún más. Para la congelación de las células, eliminar el medio de cultivo, enjuagar el recipiente con 10 ml de PBS para eliminar los restos de medios de comunicación y de superposición con 3 ml de solución / EDTA tripsina. Incubar durante 3-5 min a 37 ° C, inactivar la digestión con tripsina añadiendo 5 ml de medios de comunicación y la transferencia de MEF a un tubo de centrifugación de 15 ml. Haga girar hacia abajo y volver a suspender el sedimento en 3 ml de congelación medios de comunicación. Traslado al 3 crioviales y congelar en un recipiente de congelación celular. 3. Reprogramación de MEFs ove_content "> NOTA: Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 5 min a 4 ° C y utilizar incubadoras de cultivo de tejidos para la reprogramación normóxicas Puede ser beneficioso para derivar y ampliar MEFs bajo condiciones de hipoxia (5% de oxígeno, véase la discusión para más información. ). Descongelar rápidamente un criovial paso bajo (P0-P1, con 2-3 células de Mio) en un baño de agua (37 ° C) y transferir el contenido en un tubo con 10 ml de medio MEF pre-calentado. Precipitar las células, volver a suspender en medios MEF 12 ml frescas, transferir a un recipiente de cultivo T75 gelatina recubiertos, y permiten que las células se recuperen durante 24-48 horas antes de continuar. Nota: MEFs también se pueden usar directamente después de la derivación. Después de la eliminación de medios de cultivo, lavar con PBS y MEFs cellularize mediante la superposición con una solución de tripsina / EDTA (3 ml para 3-5 min a 37 ° C). Se inactiva la tripsina mediante la adición de 5 ml de medio MEF y disociar además células por mezclado suave con una pipeta de 10 ml. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro. Para reprograexperimentos Mming, MEFs semillas Onto frascos T75 recubiertos con gelatina a densidades de 6,7 x 10 3 células / cm 2 (~ 0,5 millones de células por frasco) en los medios de comunicación IPSC que contienen 2 mg / ml de doxiciclina. Consulte la Tabla 1 con respecto a las recomendaciones de siembra para obtener alrededor de 2 Mio intermedios de reprogramación para cada punto de tiempo. Nota: La reprogramación se inicia con la adición de doxiciclina (2 mg / ml) suplementado medios Para los primeros 6 días a sustituir los soportes cada dos días con doxiciclina fresco complementado medios IPSC (12 ml de medio por matraz T75). Más allá de este punto de renovar los medios de comunicación sobre una base diaria si hay números altos de células. El doble de volumen de cultivo si los cambios de medios sólo se pueden realizar cada dos días. Intermedios de reprogramación de la cosecha en los puntos de tiempo requeridos (sugerencia: días 3, 6, 9, 12) mediante la eliminación de los medios de comunicación, aclarando con volumen apropiado de PBS (10 ml para un matraz T75) y la superposición con una solución de tripsina-EDTA (3 ml para una matraz T75). Incubardurante 3-5 minutos a 37 ° C y se inactiva mediante la adición de 5 ml de medio de IPSC seguidos por pipeteo suave. Número de suspensión de células con un hemocitómetro (ver arriba), pellet por centrifugación, aspirar las células sobrenadante y resuspender en 10 ml de PBS para eliminar cualquier rastro de tripsina. Se precipitan las células una vez más, se aspira el sobrenadante y proceder con el paso 4.1 para aislar los productos intermedios de reprogramación. Nota: Las células que sufren la reprogramación pueden ser criopreservados y descongelado para el aislamiento FACS en una etapa posterior. Para establecer cultivos iPS totalmente reprogramadas, crecer las células en-dox libre IPSC medios durante otros 4-7 días. NOTA: Los cultivos con éxito reprogramación de contener un gran número de colonias por día 12 (ver Figura 4). Durante este tiempo, las células iPS aberrantes que aún requieren expresión OKSM desaparecerán. Alternativamente, para propagar los cultivos restantes iPS totalmente reprogramadas: Inicialmente, la semilla MEFs irradiados a una densidad de 15 x 10 3 células / cm 2 </shasta> en 12 ml de medio de IPSC en una gelatina recubierta T75 matraz de un día o 6 horas antes de los experimentos. A continuación, los cultivos de células iPS cellularize mediante la eliminación de los medios de comunicación, enjuagando el matraz T75 con 10 ml de PBS, con superposición de 3 ml de solución de tripsina-EDTA e incubando durante 3-5 min a 37 ° C. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 5 ml de medio de IPSC seguido de un mezclado suave, transferir a un tubo cónico de 15 ml, girar hacia abajo y luego se resuspendieron en 10 ml de medios de comunicación iPS. Transferir 500 l de esta suspensión de células en los MEFs irradiados (matraz T75) y permitir que los cultivos crezcan durante 4-5 días. Nota: culturas iPS establecidas pueden ser criopreservados o utilizados para experimentos. Líneas celulares clonales se pueden derivar por recoger colonias individuales IPSC bajo un microscopio de disección 22. Cryo preservar culturas IPSC confluentes como se describe en 2.8 para MEFs. 4. Anticuerpo etiquetado Volver a suspender los sedimentos celulares de las culturas de reprogramación, que se preparaba en la Sección 3, enFACS medios etiquetado complementado con anticuerpos (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotina 1: 400 y anti-EpCAM Fitc 1: 400). Utilice 200 l de mezcla de marcaje complementado por 5 millones de células y se incuba en hielo. Después de 10 min golpee suavemente el tubo para resuspender las células y se incuba durante 10 minutos adicionales en hielo. Añadir 10 ml de PBS frío por tubo y centrifugar. Para cada tubo que se va manchado preparar 200 l de material de etiquetado suplementado con 1 l de estreptavidina-PeCy7 (1: 200) por 5 millones de células. Cuando las células han sedimentado, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en un volumen apropiado de los medios de etiquetado suplementadas con estreptavidina-PeCy7. Mantener las células en hielo durante 10 min, toque para volver a suspender, incubar durante otros 10 minutos en hielo, añadir 10 ml de PBS frío por tubo, centrifugar y sobrenadante aspirado. Resuspender los sedimentos celulares en medios suplementados etiquetado con yoduro de propidio (PI) (2 mg / ml) a aproximadamente 1 x 10 7 células / ml. Eliminar grupos de células haciendo pasar la suspensión a través de un colador de 70 micras. Transferir las células a un tubo de FACS apropiado y mantenerlos en hielo. Preparar muestras separadas con anticuerpos individuales (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 y anti-EpCAM). NOTA: Estos están obligados a realizar la compensación de color en los tres canales utilizados en el análisis. Además, se necesitan células no marcadas para ajustar los voltajes y puertas para la clasificación. Lo ideal sería que las células iPS se utilizan para la compensación: existencias de 0,5 a 1 x 10 6 células iPS mantenidos en MEFs irradiados se almacenan en crioviales en nitrógeno líquido. La presencia de MEFs es esencial para obtener una señal en el canal de Thy-1.2. Descongelar un criovial de células iPS como se describe para MEFs (sección 3). Después de la centrifugación, se resuspenden las células en 800 l de tampón de etiquetado y 200 l de esta muestra se encuentra a un lado como el control sin etiquetar. Utilizar las células restantes como controles de compensación. Las células se dividen entre tres tubos de 15 ml y añadir anticuerposcomo sigue: Pacific Blue control de compensación de: añadir 0,5 l de anticuerpo anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tubo de compensación FITC: añadir 0,5 l de anticuerpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 control de compensación: 0,5 l de anticuerpo anti SSEA-1-biotina. Mantener las muestras de células de anticuerpos en hielo durante 10 min, la mezcla tocando y se incuba durante 10 min en hielo. Lávese las muestras con 10 ml de PBS frío para eliminar el anticuerpo no unido, giran celdas hacia abajo y aspirar el sobrenadante. Sedimentos celulares Resuspender en 200 l de FACS medios etiquetado. Por contra SSEA-1-biotina-etiquetados muestras, añadir un conjugado estreptavidina-PeCy7 (1 l por 200 células mu l). Células de la etiqueta como se describe para el anticuerpo primario (SSEA-1-Biotina). Pasar todas las muestras incluyendo el control no marcado a través de un colador de 70 micras y añadir PI (2 g / ml). Transferir las células a tubos de FACS y mantener en hielo hasta que se requiera. 5. FACS Aislamiento de los Intermedios Nota:Las células se clasifican usando un clasificador celular activado por fluorescencia con 405 nm, 488 nm y 560 nm de excitación láser y una boquilla de 100 micras. Configuración de los voltajes de dispersión frontal y lateral de manera que la población de células se visualiza correctamente. Dibujar una puerta alrededor de las células como se indica en la figura 5A para excluir los desechos. Nota: La configuración correcta de las tensiones en el clasificador de células puede ser complejo y requiere un operador experimentado FACS. Uso dispersión frontal (FSC) de altura frente a área FSC excluir agregados (Figura 5B). Visualice el canal PI frente FSC a puerta en las células vivas negativos PI (Figura 5C). Utilice las células no marcadas para ajustar los voltajes para los canales fluorescentes de PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posicionar la población de células en el extremo inferior del canal respectivo. Conjunto puertas con las células de control no marcados como se muestra en la Figura 6A, B a la fracción sub el culto reprogramaciónUres en el día 3, 6 y 9 poblaciones: SSEA-1-/ Thy-1.2 + células; SSEA-1-/ Thy-1.2- células; y la reprogramación como intermediaria en SSEA-1 + / células Thy-1.2-. Además subdividir el día 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- fracción usando el Pe-Cy7 frente Fitc blot; dibujar puertas alrededor de la ESS-a1 + / + células las células / Epcam- SSEA-1 EpCAM + y. Conjunto puertas con las células de control no marcados como se muestra en la Figura 6C, D. Prellenado tubos de recogida apropiados con los medios de comunicación de células iPS (1-2 ml) antes de la clasificación de las subpoblaciones que desee (vea la Figura 7 para FACS perfiles representativos de MEFs, Día 3 / Día 6 / Día 9/12 Día de las culturas y las células iPS). Realizar FACS clasificación de acuerdo con fabrica protocolo. Después del aislamiento FACS someter las células a perfiles moleculares (ARN / extracción de proteínas, la inmunoprecipitación de la cromatina, ADN metiloma análisis, etc). Alternativamente, las diversas fracciones de células pueden ser cultivadas.