Produzione di Haploid Zebrafish embrioni da<em> In Vitro</em> Concimazione
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
Il pesce zebra è diventato un modello vertebrato tradizionale che è rilevante per molte discipline di studio scientifico. Zebrafish sono particolarmente adatti per l'analisi genetica in avanti dei processi di sviluppo a causa della loro fecondazione esterna, dimensione embrionale, rapido ontogenesi e chiarezza ottica – una costellazione di tratti che consentono l'osservazione diretta degli eventi che vanno da gastrulation a organogenesi con uno stereomicroscopio di base. Inoltre, gli embrioni di zebrafish possono sopravvivere per diversi giorni in stato aploidi. La produzione di embrioni aploidi in vitro è un potente strumento per l'analisi mutazionale, in quanto consente l'identificazione delle recessivi alleli mutanti presenti nella prima generazione (F1) femmine portatrici seguenti mutagenesi nel parentale (P) generazione. Questo approccio elimina la necessità di sollevare più generazioni (F2, F3, ecc) che coinvolge allevamento di famiglie mutanti, risparmiando così il tempo ricercatore insieme a ridurrele esigenze di spazio zebrafish colonia, del lavoro e dei costi di allevamento. Sebbene zebrafish sono stati utilizzati per condurre avanti schermi per gli ultimi decenni, vi è stata una costante espansione di transgenici e genoma strumenti di editing. Questi strumenti offrono ora una pletora di modi per creare saggi sfumati per gli schermi di nuova generazione che possono essere utilizzati per analizzare ulteriormente le reti di regolazione genica che guidano vertebrati ontogenesi. Qui, descriviamo come preparare gli embrioni aploidi zebrafish. Questo protocollo può essere implementato per nuovi schermi aploidi futuri, come nelle schermate enhancer e soppressori, per affrontare i meccanismi di sviluppo per una vasta serie di processi e tessuti che si formano durante le fasi embrionali precoci.
Introduction
I processi fondamentali che orchestrano sviluppo dei vertebrati sono ampiamente conservati 1. Un modo efficace per identificare i geni con ruoli essenziali in sviluppo è isolare mutazioni ereditarie che portano a difetti fenotipici nel processo di interesse. Lo zebrafish, Danio rerio, è una piccola specie di acqua dolce teleostei appartenenti alla famiglia dei pesci ciprinidi che è diventato un ampiamente usato organismo modello per la genetica dello sviluppo dei vertebrati nel corso degli ultimi decenni 2. Uova di zebrafish sono fecondate all'esterno, permettendo l'accesso al zigote fin dall'inizio della fecondazione 3. Inoltre, l'embrione precoce è otticamente trasparente, consentendo la visualizzazione di sviluppo con un semplice stereomicroscopio 3. Ontogenesi zebrafish è rapido, con i processi di segmentazione, gastrulazione, organogenesi e di numerose strutture, come il cuore e rene, sostanzialmente completata nell'arco del primo giorno di sviluppo 3. Tha tempo da stadi larvali alla maturità sessuale richiede 2-3 mesi, e gli adulti sono piccoli vertebrati circa 3-4 cm di lunghezza, tanti i pesci possono essere mantenute in uno spazio minimo 2. Inoltre, gli adulti di zebrafish hanno alta fecondità, con ogni pesce in grado di produrre diverse centinaia di embrioni a settimana 2. Questi attributi hanno reso la trattabilità di zebrafish per la marcia avanti e indietro schermi genetiche. Zebrafish in possesso di un alto grado di conservazione nella loro anatomia, biologia cellulare, la fisiologia e con più specie di vertebrati avanzate come i mammiferi 2,4. Infatti, recenti analisi della sequenza ha dimostrato che il genoma zebrafish contiene omologhi a quasi il 70% dei geni umani 5. Tale conservazione ha permesso ai ricercatori di utilizzare zebrafish come modello per numerose malattie umane, tra cui sia embrionale e le condizioni di adulti 2,4. Presi insieme, questi fattori hanno reso zebrafish un ottimo sistema per schermi volta ad individuare i geni che sonoessenziale per la normale ontogenesi vertebrati.
Un certo numero di schermi di grandi dimensioni sono state effettuate in zebrafish e hanno identificato diverse migliaia di mutazioni in geni dello sviluppo 6-8. Il maschio adulto zebrafish è suscettibile di mutagenesi, e alterazioni cromosomiche può essere generato con frequenza relativamente alta con il etilnitrosourea mutageno chimico (ITA) 6,7 o retrovirale mutagenesi inserzionale 9. Ad oggi, oltre 9.000 mutazioni ereditarie sono stati creati, e comprendono geni che influenzano virtualmente tutti gli aspetti della embriogenesi. La comunità zebrafish ha istituito una banca centralizzata di questi mutanti presso il Centro Zebrafish International Resource (o Zirc) 10, che ha raccolto circa 5.000 alleli mutanti e transgenici provenienti da tutto il mondo. Molte di queste mutazioni sono state analizzate e clonati, dando ai ricercatori attraverso discipline biologiche preziose informazioni che è stato usato per prendere in giro a parte NUMEROci vie cellulari e fisiologiche attraverso le intuizioni originarie con gli esperimenti di zebrafish.
Sebbene gli schermi a termine hanno identificato un numero impressionante di geni importanti, molto deve ancora essere apprezzato per le reti di regolazione genetica che mediano una miriade di processi. Molti schermi intraprese finora non hanno raggiunto la saturazione, e quindi avanti così come gli schermi genetici inversa sono rimasti una pietra miliare per identificare e analizzare i meccanismi dell'embriogenesi. Mentre ci sono enormi intuizioni che si può ricavare da ogni singola linea mutante zebrafish, un importante fattore limitante nel campo è stato storicamente lo sforzo che richiede tempo coinvolto nella clonazione posizionale. Per questo motivo, l'identità di molte mutazioni indotte chimicamente è rimasto un mistero. Tuttavia, con il recente avvento di interi genomi approcci di sequenziamento che facilitano la rapida clonazione 11-14, l'identificazione incredibilmente efficiente delle mutazioni genetiche è ora feasible.
La schermata avanti prototipo in zebrafish è uno schermo diploide che può identificare mutazioni recessive entro tre generazioni 6,7 (Figura 1, colonna a sinistra). Questa tecnica comporta mutazioni generano nelle cellule germinali del maschio parentale (P), e quindi questa accoppiamento maschio con una femmina tipo selvatico. Ciascuna delle progenie di prima generazione (F1) da questo accoppiamento si porto una o più mutazioni uniche dovute ai contributi cromosomiche del genoma paterno mutato. La progenie F1 sono sollevate e outcrossed con i tipi selvatici per creare famiglie F2. Nella famiglia F2, i fratelli saranno sia di tipo selvatico o eterozigoti, e sono incrossed casualmente per generare frizioni F3 che vengono analizzati per fenotipo (s) di interesse. Le frizioni F3 di portatori eterozigoti contengono il 25% di tipo selvatico, il 50% eterozigote, e il 25% di pesce mutante omozigote. Questo schema di screening multi-generazionale è efficace, tuttavia un grave inconveniente per questo unAPPROCCIO comprende il tempo necessario per prepararsi per il grande schermo: almeno 1 anno di solo pesce di allevamento è coinvolto, dal momento che ogni generazione richiede circa 3 mesi per raggiungere la maturità sessuale. Altre limitazioni di questo tipo di schermo diploide sono opera, spazio e costo degli alloggi queste generazioni.
Lo schermo aploide è una alternativa che può essere utilizzato per identificare e quindi isolare mutazioni recessive utilizzando strategie di mutagenesi simili 15 (Figura 1, colonna di destra). La produzione di embrioni aploidi zebrafish è stato descritto oltre 30 anni fa 16, e la capacità del zebrafish normalmente diploide sviluppare per alcuni giorni con una cromosomico aploide ploidia è stato utilizzato per numerosi studi genetici da questo momento. Il principale vantaggio dello schermo aploide è che questo metodo non comporta sollevare le famiglie F2 al fine di schermare per recessivi alleli mutanti. Invece, le femmine generazione F1 vengono valutati pereterozigosità di mutazioni recessive nel processo di interesse esaminando loro progenie F2 in una condizione aploide (Figura 1, colonna di destra). In generale, la procedura per procurarsi embrioni aploidi sono relativamente semplici (Figura 2). Dopo la preparazione delle soluzioni necessarie per la gestione dello sperma, le uova sono ottenuti da femmine della generazione F1 dalla manipolazione manuale in modo da estrudere (o "squeeze"), le uova dalla pancia. Una volta ottenute le uova, vengono fecondati in vitro mediante esposizione a raggi ultravioletti (UV) sperma inattivato. Lo sperma inattivato UV sono incapaci di contribuire DNA praticabile per l'uovo a causa del fatto che la breve lunghezza d'onda UV reticola il DNA paterno. Tuttavia, gli spermatozoi sono ancora in grado di innescare l'attività uovo e gli eventi associati con lo sviluppo dello zigote. Dopo l'attivazione metabolica, l'uovo completerà la meiosi II, e procedere a svilupparsi con solo una copia materna depositato di ogni chromosome. A causa di questo 1N ploidia, l'embrione è soggetto alle conseguenze dello sviluppo di un allele mutante recessivo, se presente su un cromosoma materno. Così ogni frizione aploidi F2 conterrà il 50% di tipo selvatico e il 50% degli embrioni mutanti se la madre è portatrice eterozigote di un allele recessivo a penetranza completa. Questa distribuzione dei genotipi embrionali ha la relativa facilità in termini di valutazione della frizione per la presenza di fenotipo mutante (s) di interesse. Se viene rilevato un tale fenotipo, il fondatore femmina generazione F1 è successivamente outcrossed di tipo selvaggio zebrafish maschile per creare e raccogliere più portatori eterozigoti. Poiché non è necessario alzare più generazioni per eseguire lo schermo, il ricercatore può risparmiare tempo, lavoro e spazio acquario, ma ha ancora il potere di rilevare un numero significativo di genomi in base al numero di femmine F1 esaminato. Così, schermi aploidi sono particolarmente fattibili per piccoli laboratori o progetti avviati nel absence di cospicui finanziamenti.
Tuttavia, ci sono numerose limitazioni e svantaggi all'utilizzo di aploidi. In primo luogo, gli embrioni aploidi zebrafish vivono solo per alcuni giorni, e di solito muoiono tra 3 e 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) 15. Embrioni aploidi zebrafish possono essere distinti da diploidi sulla base di alcune caratteristiche, primo fra tutti essere un corpo corto e tozzo che ha comunque il normale numero di segmenti somite 15,17. Dato che lo sviluppo progredisce, le mostre del cervello aumento della morte cellulare e la circolazione è scarsa, di solito associati a una pozza di sangue da 2-3 dpf ed edema 15,17. Inoltre, aploidi non riescono a gonfiare un 15,17 vescica natatoria. Indipendentemente da queste differenze morfologiche, la maggior parte dei principali organi e tessuti sono formati, tra cui il cuore, occhio, e notochord 15,17. Una caratteristica notato su frizioni aploidi è che essi contengono una serie di fenotipi in termini di varietà di embrioni difettosi & #8212; una caratteristica osservata in ceppi di zebrafish. Pertanto, si dovrebbe verificare se il tessuto (s) e il punto di tempo di interesse mostrano sviluppo ragionevolmente normale nel ceppo selvatico aploide e quindi potenzialmente essere valutati per difetti genetici in uno schermo o altro progetto di ricerca.
Nonostante queste sfide, schermi aploidi sono state implementate con successo per identificare i geni necessari per i processi di sviluppo anticipato in zebrafish e protocolli aploidi sono stati ben stabiliti le risorse della comunità per molti anni 15-19. Più recentemente, il processo di generazione di embrioni aploidi pesce è stato usato dai ricercatori per creare aploide staminali embrionali (ES) colture cellulari dal pesce Medaka 20,21. Dopo la produzione di embrioni Medaka aploidi in vitro, gli embrioni sono stati usati per derivare colture cellulari primarie che sono state fatte passare per 15 settimane, seguite da altri 5-8 settimane per generare cloni puri di cellule aploidi conProprietà delle cellule ES 15-19. La generazione di pesce aploidi linee di cellule staminali detiene un'ampia promessa di futuro per l'analisi dei fenotipi recessivi in linee cellulari vertebrati, e rappresenta un nuovo approccio per l'analisi genetica nei prossimi anni. Così, la generazione di embrioni di pesce aploidi è crescente applicazioni nella comunità di ricerca biomedica. In questo articolo video fornisce una dimostrazione visiva dei passaggi coinvolti con la produzione di aploidi embrioni di zebrafish in vitro con lo sperma-UV inattivato basato su protocolli stabiliti 15-19,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo screening aploide è una tecnica utile per scoprire geni essenziali necessari per le fasi precoci dello sviluppo. Inoltre, la coltura di cellule aploidi dal pesce Medaka è stato usato per isolare linee di cellule ES-simili che hanno numerose applicazioni di ricerca e potenziale, dimostrando che le cellule aploidi possono fornire un luogo prezioso futuro per altri tipi di studi genetici vertebrati 20,21. Questo protocollo fornisce una dimostrazione dei metodi coinvolti eseguire la produzione di embrioni aploidi zebrafish attraverso la fecondazione in vitro con lo sperma UV inattivato. Questa metodologia può essere utilizzato per eseguire le schermate avanti aploidi con pesce F1 mutagenizzato, che può essere fatta usando wild type, transgenici o ceppi mutanti per lo screening enhancer / soppressore.
Anche se il tempo di screening utilizzando una strategia aploidi è notevolmente ridotto rispetto allo screening diploide, sarà comunque necessari diversi mesi per completare. Come abbiamo Descriletto in precedenza, ci sono molti vantaggi che esistono eseguendo uno schermo mediante uno schema aploide, ognuno dei quali può aiutare a fare nuovi contributi alla conoscenza attuale su qualsiasi numero di eventi di sviluppo. La metodologia schermo aploide è più efficiente per l'identificazione di alleli mutanti recessivi rispetto agli schermi diploidi basata causa della riduzione del tempo, lo spazio, e il numero di pesci che sono necessari. Tuttavia, ci sono diverse insidie di uno schermo aploidi. Uno schermo haploid può identificare solo mutanti in geni che sono attivi entro i primi giorni di sviluppo, come l'embrione può sopravvivere solo per un tempo limitato con un genoma aploide. Geni che sono espressi successivamente in sviluppo dovranno essere identificati da un metodo diverso, come uno schermo diploide. Inoltre, alcuni organi non si sviluppano correttamente in un organismo aploide. Ci possono essere anomalie anatomiche, o un tempo di ritardo di sviluppo, che possono causare la mutazione da non perdere con la tecnica di screening aploidi. Ion Inoltre, alcuni ceppi di pesce non sviluppano così in una condizione aploide 15. Aploidi possono essere classificati da una serie di buoni classificazione, intermedi e poveri caratteristiche embrionali, con A embrioni è il più normale, B per designare gli embrioni con difetti di asse, ma la mente lucida e la coda, e C / D per designare gli embrioni con irriconoscibili caratteristiche (masse di cellule in cima palle tuorlo) 15,17. Le proporzioni di embrioni all'interno di queste categorie varia da ceppo zebrafish, con aumento del numero di migliore qualità aploidi più prevalenti in particolare background genetico 15,17. A causa di questi fattori, è necessario trovare un giusto ceppo di zebrafish effettuare la mutagenesi e croci successivi. Nella nostra recente esperienza, il tipo selvatico Tübingen ceppo prodotta aploidi vitali per lo screening (come mostrato nelle figure 3 e 4) se i ricercatori storicamente zebrafish hanno utilizzato l'AB o AB * ceppi per sperim aploidisentazione 15.
Oltre a questi problemi citati in precedenza, non tutte le femmine zebrafish adulto innescati produrranno una frizione upon eseguire la tecnica di spremitura. Ad esempio, nel lavoro con ENU-mutagenizzate femmine deformazione Tubinga, circa la metà di tutte le donne ha prodotto una frizione su spremitura, e una frazione di questi (tipicamente 10-30%) erano scarsa qualità embrione o non è stato fecondato. Quindi, effettuare una schermata aploide bisogna pianificare per raccogliere almeno doppio dei pesci come necessario per schermare il numero desiderato di genomi (ogni femmina rappresenta uno genoma proiettato). Indipendentemente da questa considerazione, i vantaggi del metodo di screening di aploide a coprire un gran numero di genomi senza stabulario massiccia sono effettivamente abbastanza significativo se il saggio è riconducibile allo stato aploide. Tuttavia, va anche notato che l'ulteriore studio della mutazione (s) identificato nella frizione aploide è completamente dipendente dalle sollevando successo unn out-cross dal fondatore femminile. Come con qualsiasi schermo, 'colpi' inizialmente individuate durante il processo di screening devono essere nuovamente identificati nello stato diploide.
Nonostante le insidie di utilizzare lo schermo aploidi, ha dimostrato di essere molto efficace per identificare mutanti, che sono state analizzate in profondità con guadagni penetranti al campo scientifico 15. Schermi aploidi possono essere implementate per studiare altri processi poco conosciute di sviluppo dei vertebrati. Utilizzando aploidi per schermi enhancer e soppressori è un modo per ottenere un quadro più chiaro delle attività e la rete di regolamentazione di un gene di interesse. La tecnica di screening aploide può anche essere utilizzato per identificare esaltatori e soppressori di mutanti che sono già stati isolati con metodi quali la mutagenesi inserzionale o chimica o genetica inversa approcci come tecniche di lavorazione oppure Talens. In breve, il mutante in precedenza isolato può essere mutagenizzato con ENU e screening per esaltatori o suppressors del fenotipo mutante originale. Il mutante deve essere in grado di raggiungere stadi adulti, quindi è necessario avere un animale eterozigote o un debole omozigote mutante pesce effettuare questa schermata, tuttavia recenti progressi nella transgenesi hanno permesso ai ricercatori di gonna questo problema. Imparare a manipolare percorsi di sviluppo può portare a molte possibilità interessanti, tra cui la prospettiva di percorsi perturbanti per il trattamento di stati di malattia.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di RAW dal seguente: sovvenzioni NIH K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award # 5-FY12-75; avviare i fondi presso l'Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche; e un generoso dono alla University of Notre Dame di Elizabeth e Michael Gallagher, a nome della famiglia Gallagher a promuovere la ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro supporto, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e nel benessere della nostra colonia zebrafish. Ringraziamo GF Gerlach per scattare le fotografie fornite nella Figura 4. Infine, ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e nshts su questo lavoro.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Referenzen
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