Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em> In-vitro-</em> Düngung
Summary
The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Abstract
Der Zebrafisch hat sich zu einem Mainstream-Wirbeltier-Modell, das für viele Disziplinen der wissenschaftlichen Studie relevant ist. Zebrafische sind besonders gut für die Vorwärts genetische Analyse von Entwicklungsprozessen geeignet, die aufgrund ihrer äußeren Befruchtung, embryonale Größe, schnelle Ontogenese und optische Klarheit – eine Konstellation von Eigenschaften, die die direkte Beobachtung von Veranstaltungen von der Gastrulation zu Organogenese mit einer grundlegenden Stereomikroskop ermöglichen. Ferner kann Zebrafischembryonen für mehrere Tage im haploiden Zustand überleben. Die Produktion von haploiden Embryonen in vitro ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Mutationsanalyse, da sie ermöglicht die Identifizierung von rezessiven mutierten Allele in der ersten Generation (F1) Trägerinnen folgende Mutagenese in der elterlichen (P)-Generation vor. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit, mehrere Generationen (F2, F3, usw.), die Zucht von Mutanten-Familien beinhaltet zu erhöhen, so sparen die Forscher Zeit zusammen mit Reduktionsder Bedarf an Zebrafisch-Kolonie Raum, Arbeit und die Haltungskosten. Obwohl Zebrafisch verwendet worden, um nach vorne zu führen Bildschirme für den letzten Jahrzehnten hat es eine stetige Expansion von transgenen und Genom-Editing-Tools. Diese Tools bieten heute eine Fülle von Möglichkeiten, um differenzierte Tests für Bildschirme der nächsten Generation, die verwendet werden können, um weitere sezieren die Gen-regulatorischen Netzwerke, die Wirbel Ontogenese fahren erstellen. Hier beschreiben wir, wie man haploiden Zebrafischembryonen vorzubereiten. Dieses Protokoll kann für neue Zukunft haploiden Bildschirme, wie in Enhancer-und Suppressor-Screens durchgeführt werden, um die Mechanismen der Entwicklung für eine große Anzahl von Prozessen und Gewebe, die während der frühen embryonalen Stadien bilden, zu adressieren.
Introduction
Die grundlegenden Prozesse, die Entwicklung von Wirbeltieren zu orchestrieren sind breit konserviert ein. Ein guter Weg, um Gene mit wichtigen Rollen in der Entwicklung zu identifizieren, ist vererbbare Mutationen, die zu phänotypischen Defekte in den Prozess der Zinsen führen zu isolieren. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist eine kleine Süßwasserknochenfischarten an den Cyprinidae Fischfamilie, die zu einem weit verbreiteten Modellorganismus für Wirbeltier-Entwicklungsgenetik in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich gehört. Zebrabärblingeier extern befruchtet wird, die den Zugang zu der Zygote vom Beginn der Befruchtung 3. Ferner ist der frühe Embryo optisch transparent, so dass die Visualisierung der Entwicklung mit einem einfachen Stereo 3. Zebrafisch Ontogenese schnell ist, mit den Verfahren der Spaltung der Gastrulation und Organogenese viele Strukturen, wie Herz und Niere, im Wesentlichen über dem ersten Tag der Entwicklung 3 abgeschlossen. Ter Zeit von Larvenstadien bis zur Geschlechtsreife dauert 2-3 Monate, und die Erwachsenen sind kleine Wirbeltiere ca. 3-4 cm in der Länge, so viele Fische auf kleinstem Raum 2 gehalten werden. Darüber hinaus haben Zebrafisch Erwachsenen hohe Fruchtbarkeit, mit jedem Fisch in der Lage, mehrere hundert Embryonen pro Woche 2 zu produzieren. Diese Attribute haben die Lenkbarkeit des Zebrafisches für Vorwärts-und Rückwärts gemacht genetischen Bildschirme. Zebrafische besitzen einen hohen Grad der Erhaltung in ihrer Anatomie, Zellbiologie und Physiologie mit fortgeschrittenen Wirbeltiere wie Säugetiere 2,4. In der Tat hat die jüngste Sequenzanalyse zeigte, dass das Zebrafischgenom Homologe zu fast 70% der menschlichen Gene 5. Diese Konservierung konnten die Forscher Zebrafisch als Modell für zahlreiche menschliche Krankheiten, einschließlich sowohl embryonalen und adulten Bedingungen 2,4 zu verwenden. Zusammengenommen haben diese Faktoren Zebrafisch ein ausgezeichnetes System für Bildschirme zu identifizieren Gene, die ausgerichtet sind gemachtessentiell für die normale Wirbel Ontogenese.
Eine Reihe von großen Bildschirmen wurden im Zebrafisch durchgeführt und mehrere tausend Mutationen in Entwicklungsgenen 8.6 identifiziert. Der Zebrafisch männlichen Erwachsenen zugänglich ist Mutagenese und chromosomale Veränderungen mit relativ hoher Frequenz mit dem chemischen Mutagen Ethylnitrosoharnstoff (DEU) 6,7 oder retrovirale Insertionsmutagenese 9 erzeugt werden. Bis heute sind über 9.000 vererbbare Mutationen wurden erstellt und beinhalten Gene, die praktisch alle Aspekte der Embryogenese beeinflussen. Der Zebrafisch-Community hat eine zentrale Bank dieser Mutanten im Zebrafisch International Resource Center (oder ZIRC) 10, die rund 5.000 Mutante und transgenen Allele aus der ganzen Welt gesammelt hat, gegründet. Viele dieser Mutationen wurden analysiert und kloniert, was Forscher über biologische Disziplinen wertvolle Informationen, die verwendet wurde, auseinander zu necken numerouns zellulären und physiologischen Wege durch die Erkenntnisse Ursprung mit Zebrafisch Experimenten.
Obwohl vorne Bildschirme haben eine beeindruckende Reihe wichtiger Gene identifiziert, viel ist noch nicht über die genetischen Regulationsnetzwerke, die eine Vielzahl von Prozessen zu vermitteln geschätzt. Viele Bildschirme bisher unternommen haben, nicht erreicht Sättigung, und damit sowohl vorwärts als auch Rückwärts genetischen Bildschirme haben ein Grundstein zu identifizieren und zu analysieren, Mechanismen der Embryogenese geblieben. Zwar gibt es enorme Erkenntnisse, die von jedem einzelnen Zebrafisch-Mutante Linie entnommen werden kann, ist ein wichtiger limitierender Faktor im Bereich historisch die zeitraubende Aufwand in der Positions Klonen beteiligt. Aus diesem Grund hat die Identität vieler chemisch induzierte Mutationen ein Rätsel geblieben. , Mit dem Aufkommen von Genomsequenzierungsansätze, die eine schnelle Klonen 11-14 zu erleichtern, ist aber unglaublich effiziente Identifikation von genetischen Mutationen nun feasible.
Die prototypische Vorwärts Bildschirm in der Zebrafisch ist ein Bildschirm, der diploiden rezessive Mutationen innerhalb von drei Generationen 6,7 identifizieren kann (Abb. 1, linke Spalte). Diese Technik beinhaltet Erzeugung von Mutationen in den Keimzellen der Eltern (P) männlich, und dann diese Paarung Männchen mit einem Wildtyp-Weibchen. Jede der ersten Generation (F1) Nachkommen von dieser Gegen eine oder mehrere einzigartige Mutationen aufgrund der chromosomalen Beiträge des mutierten väterlichen Genom beherbergen. Die F1-Nachkommen werden angehoben und mit Wildtypen F2 Familien zu schaffen kreuzt. In der F2-Familie, Geschwister wird entweder Wildtyp-oder heterozygote Träger sein und werden zufällig incrossed bis F3 Kupplungen, die für Phänotyp (e) von Interesse analysiert werden, erzeugen. Die F3 Fängen der heterozygote Träger 25% Wildtyp, 50% heterozygot und 25% homozygot mutierten Fisch enthalten. Das Mehr-Generationen-Screening-Schema ist wirksam, jedoch einen großen Nachteil dieser einNSATZ beinhaltet die erforderliche Zeit, um für den Bildschirm vor: mindestens 1 Jahr von Fischhaltung allein beteiligt ist, da jede Generation erfordert etwa 3 Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Weitere Einschränkungen dieser Art von diploiden Bildschirm sind die Arbeit, Raum und Kosten für Wohn diese Generationen.
Die haploiden Bildschirm ist eine Alternative, die verwendet werden können, zu identifizieren und anschließend zu isolieren rezessive Mutationen werden mit ähnlichen Mutagenesestrategien 15 (Abbildung 1, rechte Spalte). Die Herstellung von haploiden Zebrafischembryonen wurde erstmals vor über 30 Jahren 16 beschrieben, und die Fähigkeit der Zebrafisch normalerweise diploiden für mehrere Tage mit einem haploiden Chromosomen Ploidie entwickeln für zahlreiche genetische Studien seit dieser Zeit verwendet. Der große Vorteil des haploiden Bildschirm ist, dass diese Methode nicht um Erhöhung F2 Familien, um für rezessive Mutante Allele zu screenen. Stattdessen werden die F1-Generation Weibchen ausgewertetHeterozygotie rezessiver Mutationen in den Prozess von Interesse durch die Untersuchung ihrer F2-Nachkommen in einem haploiden Zustand (Fig. 1, rechte Spalte). Insgesamt sind die Schritte zu haploiden Embryonen relativ einfach zu beschaffen (Abbildung 2). Nach Herstellung der erforderlichen Lösungen für die Spermien Handhabung sind Eier von F1-Generation Weibchen durch manuelle Manipulation erhalten wird, um aus dem Bauch zu extrudieren (oder "Squeeze") die Eier. Sobald die Eier erhalten werden, werden sie in vitro durch Exposition gegenüber ultravioletter (UV) inaktiviert Spermium befruchtet. Die UV-inaktivierten Sperma unfähig sind lebensfähige DNA beiträgt, das Ei durch die Tatsache, dass die kurzwellige UV-vernetzt das väterliche DNA. Allerdings sind die Spermien noch in der Lage Auslösen Ei-Aktivität und die Ereignisse mit zygotische Entwicklung verbunden. Bei Stoffwechselaktivierung, wird das Ei Meiose II abzuschließen, und fahren Sie mit nur der einen mütterlich hinterlegt Kopie jeder chromosomale entwickelnmich. Aufgrund dieser 1N Ploidie ist der Embryo unter den Entwicklungs Folgen eines rezessiven mutierten Allels, wenn sie auf einer mütterlichen Chromosom vorhanden ist. So ist jedes F2 haploiden Kupplung werden 50% und 50% Wildtyp-Mutante Embryonen enthalten, wenn die Mutter ist eine heterozygote Träger eines voll penetrant rezessive Allel. Diese Verteilung der embryonalen Genotypen können relativ leicht in Bezug auf die Beurteilung der Kupplung auf die Anwesenheit von Mutanten-Phänotyp (en) von Interesse. Wenn ein solcher Phänotyp erkannt wird, wird der weibliche Gründer F1-Generation nachträglich zu Wildtyp männlichen Zebrafisch kreuzt mehr heterozygote Träger zu schaffen und zu erhöhen. Denn es ist nicht notwendig, mehrere Generationen anzuheben, um den Bildschirm durchzuführen, kann der Forscher viel Zeit, Arbeit und Aquarium Platz zu sparen, hat aber immer noch die Macht, eine beträchtliche Anzahl von Genomen, basierend auf der Anzahl der F1-Weibchen untersucht Umfrage. So sind haploid Bildschirme vor allem machbar für kleine Labors oder Projekte in der absenc eingeleitete erhebliche Mittel.
Es gibt jedoch mehrere Beschränkungen und Nachteile der Verwendung von Haploiden. Erstens leben haploiden Zebrafisch-Embryonen nur für einige Tage, und in der Regel sterben zwischen 3 und 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) 15. Haploid Zebrafischembryonen aus Diploiden auf der Grundlage verschiedener Merkmale unterschieden werden, vor allem unter ihnen ist eine kleine, kompakte Körper, dennoch hat die normale Anzahl von Somiten Segmente 15,17. Da die Entwicklung fortschreitet, erhöht die Gehirn Exponate Zelltod und Kreislauf ist schlecht, mit Blut-Pooling in der Regel von 03.02 dpf und Ödeme 15,17 verbunden. Ferner Haploiden nicht, eine Schwimmblase 15,17 aufzublasen. Unabhängig von diesen morphologischen Unterschiede, sind die meisten wichtigen Organe und Gewebe gebildet, einschließlich Herz-, Augen-und Rückensaite 15,17. Ein Merkmal hingewiesen zu haploiden Kupplungen ist, dass sie enthalten eine Reihe von Phänotypen in Bezug auf Sorten von defekten Embryonen & #8212; ein Feature, über Zebrafisch-Stämmen beobachtet. So sollte man überprüfen, ob das Gewebe (n) und die Zeit von Interesse zeigen maßen normale Entwicklung im Wildtyp haploiden Stamm und haben daher das Potenzial, auf genetische Defekte in einem Bildschirm oder andere Forschungsprojekt ausgewertet werden.
Trotz dieser Herausforderungen haben haploiden Bildschirme erfolgreich umgesetzt worden, um Gene für die frühen Entwicklungsprozesse in der Zebrafisch notwendig, zu identifizieren und haploiden Protokolle wurden auch in der Gemeinde seit vielen Jahren etabliert 15-19 Ressourcen. In jüngerer Zeit hat der Prozess der Erzeugung haploiden Fischembryonen von Forschern verwendet worden, um haploide embryonale Stammzellen (ES)-Zellkulturen aus Medakafisches 20,21 erstellen. Nach der Herstellung des Medaka haploiden Embryonen in vitro wurden die Embryonen verwendet werden, um primäre Zellkulturen, die für etwa 15 Wochen, gefolgt von weiteren 5-8 Wochen zu rein Klone von haploiden Zellen erzeugen agiert wurden ableitenES-Zell-Eigenschaften 15-19. Die Erzeugung von Fisch haploiden ES-Zelllinien hält Versprechen für zukünftige breite Analyse rezessive Phänotypen in Wirbeltier-Zelllinien und stellt einen neuen Ansatz für die genetische Analyse in den kommenden Jahren. Somit wird die Erzeugung von Fisch haploiden Embryonen wachsenden Anwendungen in der biomedizinischen Forschung. Dieses Video Artikel bietet eine visuelle Demonstration der Schritte, mit der Herstellung von haploiden Zebrafisch-Embryonen in vitro mit UV-inaktivierten Spermien basierend auf etablierten Protokollen 15-19,22 beteiligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Haploid Screening ist eine nützliche Technik, um essentielle Gene Voraussetzung für frühen Entwicklungsstadien zu entdecken. Weitere, Anzucht von haploiden Zellen aus dem Medaka-Fisch verwendet wurde, um ES-Zelllinien, die wie zahlreiche Forschungsanwendungen und Potenzial, die zeigen, dass haploide Zellen eine wertvolle Zukunft Austragungsort für andere Arten von Wirbeltieren genetische Studien 20,21 liefern zu isolieren. Dieses Protokoll bietet eine Demonstration der mit der Durchführung der Produktion von haploiden Zebrafischembryonen durch in-vitro-Fertilisation mit UV inaktiviert Spermien beteiligt Methoden. Diese Methode kann verwendet werden, um vorwärts haploiden Bildschirme mit mutagenisierten F1 Fische, die mit Wildtyp-oder transgenen Mutanten-Stämme für Enhancer / Suppressor-Screening vorgenommen werden können durchzuführen.
Obwohl das Screening Zeit mit einem haploiden Strategie ist enorm im Vergleich zu diploiden Screening verkürzt, wird es dennoch mehrere Monate in Anspruch nehmen. Wie wir beschriezuvor Bett, es gibt viele Vorteile, die durch Ausführen einer Bildschirm mit einem haploiden Schema, die alle bei der Herstellung neuartiger Beiträge zum aktuellen Wissen über eine beliebige Anzahl von Entwicklungs-Ereignissen zu erleichtern existieren. Die haploiden Bildschirm-Methodik ist für die Identifizierung der rezessiven mutierten Allelen als diploide-basierte Bildschirme aufgrund der Reduzierung von Zeit, Raum und die Anzahl der Fische, die benötigt werden effizienter. Allerdings gibt es einige Fallstricke zu einem haploiden Bildschirm. Ein Bildschirm kann nur haploide Mutanten identifizieren Gene, die in den ersten Tagen der Entwicklung aktiv sind, wie der Embryo kann nur für eine begrenzte Zeit zu überleben mit einem haploiden Genom. Gene, die später in der Entwicklung exprimiert werden müsste durch ein anderes Verfahren, wie beispielsweise eine diploide Bildschirm identifiziert werden. Auch einige Organe richtig in einem haploiden Organismus entwickeln nicht. Es können anatomische Anomalien, oder eine verzögerte Zeit der Entwicklung, was dazu führen kann die Mutation von haploiden Screening-Technik verfehlt werden. Ichn hinaus einige Stämme von Fisch nicht so gut entwickeln in einem haploiden Zustand 15. Haploiden kann durch eine Reihe von Sortier gute, mittlere und schlechte embryonalen Eigenschaften kategorisiert werden, mit einer Embryonen als die meisten normalen, B, Embryos mit Defekten in der Achse bezeichnen, aber ein klarer Kopf und Schwanz, und C / D, um Embryonen mit unkenntlich zu bezeichnen Funktionen (Zellmassen oberhalb Dotterkugeln) 15,17. Die Anteile von Embryonen innerhalb dieser Kategorien ist je nach Zebrafisch-Stamm, mit einer erhöhten Anzahl von besserer Qualität Haploiden häufiger in bestimmten genetischen Hintergründen 15,17. Aufgrund dieser Faktoren ist es erforderlich, einen geeigneten Stamm von Zebrafisch zu finden, um die Mutagenese und anschließende Kreuzungen durchzuführen. In unserer jüngsten Erfahrungen, produziert der Wildtyp-Stamm Tübingen tragfähige Haploiden für das Screening (wie in den 3 und 4 gezeigt), obwohl historisch Zebrafisch-Forscher haben die AB oder die AB * haploiden Stämme für experim genutztsentation 15.
Zusätzlich zu diesen oben genannten Herausforderungen werden nicht alle grundierten erwachsenen Zebrafisch Weibchen eine Kupplung auf die Durchführung der Presstechnik zu produzieren. Zum Beispiel in der Arbeit mit ENU-mutagenisierten Stamm Tübingen Weibchen produziert etwa die Hälfte aller Frauen eine Kupplung beim Zusammendrücken, und einige Bruchteil davon (in der Regel 10-30%) waren arm Embryoqualität oder konnte nicht befruchtet werden. So, um einen haploiden Bildschirm durchführen muss man planen, mindestens doppelt so viele Fische wie notwendig, um die gewünschte Anzahl von Genomen (jedes Weibchen stellt eine Genom geschirmt) Bildschirm zu erhöhen. Unabhängig von dieser Überlegung sind die Vorteile der haploiden Verfahren zum Screening einer großen Anzahl von Genomen ohne eine massive Tieranlage decken in der Tat sehr wichtig, wenn der Test zugänglich haploiden Zustand. Es sollte jedoch auch darauf hingewiesen, dass die weitere Studie über die Mutation (en) in der haploiden Kupplungs identifiziert ist vollständig abhängig von erfolgreich ein Anheben werdenn Outcross aus der weiblichen Gründer. Wie bei jedem Bildschirm 'trifft' zunächst während der Screening-Prozess identifiziert muss in der diploide Zustand wieder identifiziert werden.
Trotz der Gefahren der Verwendung der haploiden Bildschirm hat sich gezeigt, sehr erfolgreich bei der Identifizierung von Mutanten, die in der Tiefe mit aufschlussreichen Gewinne an den wissenschaftlichen Bereich 15 analysiert wurden zu sein. Haploid Bildschirmen implementiert werden, um andere schlecht verstanden Prozesse der Entwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Mit Haploiden für Enhancer und Suppressor-Bildschirme ist ein Weg, um mehr Einblick in die Aktivitäten und regulatorische Netzwerk eines Gens von Interesse zu gewinnen. Die haploiden Screening-Technik kann auch verwendet werden, um Enhancer und Suppressoren von Mutanten, die bereits durch Verfahren wie chemische oder Insertionsmutagenese isoliert oder Rückwärts Genetik Ansätze wie TILLING oder TALENS identifizieren. Kurz gesagt, kann der zuvor isolierten Mutante mit ENU Mutagenese und Verstärker oder s zu sehen seinuppressors der ursprünglichen mutierten Phänotyp. Die Mutante muss adulte Stadien zu erreichen, so ist es notwendig, einen heterozygoten Tier oder eine schwache homozygot mutierte Fische haben, um diesen Bildschirm durchzuführen, aber die jüngsten Fortschritte in der Transgenese haben es Forscher, dieses Problem zu Rock. Lernen, wie man Wege in der Entwicklung manipulieren kann auf viele spannende Möglichkeiten, einschließlich der Aussicht störenden Wege zur Behandlung von Krankheitszuständen führen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von RAW aus der folgenden unterstützt: NIH Zuschüsse K01 DK083512, DP2 OD008470 und R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Awards # 5-FY12-75; Start-up-Fonds von der Universität von Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; und ein großzügiges Geschenk an die Universität von Notre Dame Elizabeth und Michael Gallagher im Namen der Familie Gallagher zur Förderung der Stammzellforschung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in dem Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften für ihre Unterstützung, und das Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der Notre Dame für ihre herausragende Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Wir danken GF Gerlach für die Aufnahme der Fotos in Abbildung 4 vorgesehen. Schließlich danken wir allen Mitgliedern unserer Forschungslabor für ihre Kommentare, Diskussionen und unbedeutendhts über diese Arbeit.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
| Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
| XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |
Referenzen
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