Un nuevo enfoque para la recuperación Microdissection<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Las transcripciones específicas de formalina parafina fijo Embedded pulmón granulomas
Summary
Microdisección se ha empleado ampliamente para el examen de ADN, ARN, y proteínas dentro del tejido. Microscopía de captura láser (LCM) es el método más comúnmente utilizado, pero una nueva técnica de fresado, mesodissection, es recientemente disponible. Demostramos la extracción de RNA de mesodissected formalina parafina fijo diapositivas de tejidos embebidos de granulomas de Mycobacterium tuberculosis.
Abstract
Microdissection se ha utilizado para el examen de los tejidos en el ADN, el ARN y los niveles de proteína durante más de una década. Microscopía de captura láser (LCM) es la técnica de microdisección más común usado hoy en día. En esta técnica, se utiliza un láser para fundir focalmente una membrana termoplástica que se superpone a una sección de tejido deshidratado 1. La sección de tejido de material compuesto entonces se levanta y se separa de la membrana. Aunque esta técnica puede utilizarse con éxito para el examen del tejido, que consume tiempo y es caro. Además, la finalización con éxito de los procedimientos que utilizan esta técnica requiere el uso de un láser, lo que limita su uso. Un nuevo enfoque de microdisección más asequible y práctica llamada mesodissection es una posible solución a las trampas de la LCM. Esta técnica emplea el sistema de MESO-1/MeSectr moler el tejido deseado a partir de una muestra de tejido montada deslizante, mientras que al mismo tiempo la dispensación y aspiración de fluido para recuperar la muestra de tejido deseada enun poco molino de consumible. Antes de que comience el proceso de disección, el usuario alinea la parafina fijado en formol incorporado (FFPE) deslice con hematoxilina y eosina manchado (H & E) Tobogán de referencia. A partir de entonces, el operador anota el área de la disección deseada y procede a diseccionar el segmento apropiado. El programa genera una imagen archivada de la disección. La principal ventaja de mesodissection es la corta duración necesaria para diseccionar una diapositiva, teniendo un promedio de diez minutos de configurar para probar la generación en este experimento. Además, el sistema es significativamente más rentable y fácil de usar. Una ligera desventaja es que no es tan precisa como la microscopía de captura por láser. En este artículo se demuestra cómo mesodissection puede utilizarse para extraer el ARN a partir de diapositivas de granulomas FFPE causadas por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Las muestras han sido tradicionalmente microdissected manualmente, ya sea todo el tejido o diapositivas utilizando una aguja y bisturí. Para ello se requiere una clara separación entre la sección de tejido de interés y los tejidos circundantes secciones 2. Con los avances actuales en la tecnología de perfil molecular, ha habido una creciente necesidad de evaluar tejido a nivel celular. Debido a las limitaciones de microdisección manual, incluyendo técnicas de LCM se establecieron para permitir una mayor precisión de aislamiento. Esta técnica permite al investigador para aislar poblaciones de células específicas de diversos tipos de células y de diapositivas, que luego se pueden utilizar para ensayos de aguas abajo, tales como perfiles de expresión génica. Aunque es muy eficaz para los ensayos posteriores, LCM no está exenta de limitaciones. En primer lugar, LCM es un proceso costoso y consume mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza inestable de ARN, que es a menudo un reto para obtener ARN de alta calidad a partir de muestras LCM 2. Debido a la disadvantages de LCM, siguen siendo necesarios nuevos avances en la tecnología de microdisección para hacerlo más accesible a un mayor número de investigadores de una manera sensible asequible y tiempo.
Uno de estos avances en la tecnología de microdisección ahora disponible es una técnica conocida como mesodissection. En esta técnica se utiliza una máquina para moler la sección de tejido anotada de interés y aspira en una fresa de consumibles 3. A continuación, esta muestra puede ser aspirado por un tubo de recogida y se utiliza para aplicaciones posteriores. Las ventajas de este sistema son que es significativamente menos costoso y sensible al tiempo. En nuestra experiencia, el sistema permite la disección de una sección de tejido granuloma pulmonar en diez minutos. Por otro lado, LCM tradicional requeriría probablemente horas para completar el proceso. El sistema permite al operador cargar un portaobjetos de referencia a utilizar como una comparación, así como herramienta para la anotación. Además se genera un informe esbozando ªárea e de la diapositiva que se ha diseccionado. Hay dos desventajas principales de mesodissection. Aunque es eficaz en la extracción de varias celdas, es difícil aislar una sola célula. Además, la precisión de la imagen generada no es tan clara como si el uso de otros microscopios de imagen.
La tuberculosis (TB) es una importante causa de muerte de la enfermedad infecciosa de la humanidad en todo el mundo y es consecuencia de la infección por Mtb. En la mayoría de los individuos expuestos a aerosoles de Mtb, la infección está latente limitado. En por lo menos 10 millones de personas anualmente, da lugar a la enfermedad de la TB activa 4. Durante la infección latente, Mtb está contenida dentro de las lesiones pulmonares patológicos conocidos como granulomas. Por lo tanto, se ha argumentado que el resultado de la infección por Mtb se decide a nivel del granuloma 5.
Aquí demostramos cómo mesodissection se puede utilizar para microdissect granulomas causados por Mtb. Las diapositivas utilizadasson de FFPE tejido pulmonar de los macacos rhesus infectados. Para el propósito de esta demostración, vamos a diseccionar granulomas en su totalidad. También demuestran que el ARN se puede extraer de los tejidos recuperados. Esta técnica se puede aplicar a muestras de tejido de varios otros especímenes y luego se usa para una variedad de ensayos de aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection es una técnica que puede aplicarse a la extracción de RNA a partir de diapositivas de las lesiones patológicas causadas por una amplia gama de patógenos. Es una necesidad que el usuario sigue el imagen y se alinea la imagen correctamente. Para lograr esto, el instrumento debe ser calibrado siguiendo las instrucciones en el software de imágenes. Cuando la disección, si la diapositiva y área de interés siendo diseccionado no se alinean, el usuario debe volver a calibrar el instrumento. Otro paso cr?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a las siguientes NIH premios / sub-premios para el apoyo de esta investigación: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, y P51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
