مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى<em> السل المتفطرة</em> نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية
Summary
وقد استخدمت على نطاق واسع تسليخ مجهري لفحص الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات داخل الأنسجة. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن تقنية الطحن الجديدة، mesodissection، وهو متاح في الآونة الأخيرة. ونحن لشرح استخراج الحمض النووي الريبي من mesodissected الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح حبيبية المتفطرة السلية.
Abstract
وقد استخدم تسليخ مجهري لفحص الأنسجة في الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، ومستويات بروتين لأكثر من عقد من الزمان. القبض على الليزر المجهري (LCM) هو الأسلوب الأكثر شيوعا تسليخ مجهري اليوم. في هذه التقنية، يتم استخدام الليزر لإذابة الوزراء البريطانى غشاء لدن أن يعتلي قسم الأنسجة المجففة 1. ثم يتم رفع قسم الأنسجة المركبة وفصلها عن الغشاء. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تستخدم بنجاح للفحص الأنسجة، وذلك هو مضيعة للوقت ومكلفة. وعلاوة على ذلك، والانتهاء بنجاح من الإجراءات باستخدام هذه التقنية يتطلب استخدام ليزر، مما يحد من استخدامها. نهج تسليخ مجهري أكثر بأسعار معقولة وعملية جديدة تسمى mesodissection هو الحل الممكن لمطبات LCM. هذه التقنية تستخدم نظام MESO-1/MeSectr إلى طاحونة الأنسجة المطلوب من شريحة شنت عينة الأنسجة في حين الاستغناء وقت واحد والشفط السوائل لاسترداد عينة الأنسجة المطلوب فيقليلا مطحنة للاستهلاك. قبل أن تبدأ عملية تشريح، بمحاذاة المستخدم البارافين جزءا لا يتجزأ من الفورمالين الثابتة (FFPE) ينزلق مع الهيماتوكسيلين ويوزين الملون (H & E) الشريحة المرجعية. بعد ذلك، المشغل بشرح منطقة تشريح المطلوب والعائدات لتشريح شريحة المناسبة. برنامج يولد صورة أرشيفية للتشريح. والميزة الرئيسية لmesodissection هي مدة قصيرة اللازمة لتشريح شريحة، مع ما معدله عشر دقائق من إعداد لأخذ عينات من جيل في هذه التجربة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام أكثر بكثير فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستعمال. والعيب طفيف هو أنه ليست دقيقة مثل التقاط الليزر المجهري. في هذه المقالة ونحن لشرح كيف يمكن استخدام mesodissection لاستخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح من حبيبية FFPE الناجمة عن المتفطرة السلية (MTB).
Introduction
عينات تقليديا microdissected يدويا من الأنسجة إما كليا أو الشرائح باستخدام إبرة ومشرط. هذا يستلزم وجود فصل واضح بين قسم الأنسجة من الاهتمام والأنسجة المحيطة بها القسمين 2. مع التقدم الحالي في مجال تكنولوجيا التنميط الجزيئي، كانت هناك حاجة متزايدة لتقييم الأنسجة على المستوى الخلوي. بسبب القيود المفروضة على تسليخ مجهري دليل، أنشئت التقنيات بما في ذلك LCM للسماح بمزيد من الدقة العزلة. هذه التقنية تسمح للباحث لعزل السكان خلية معينة من مختلف أنواع الخلايا والشرائح، والتي يمكن ان تستخدم بعد ذلك لفحوصات المصب مثل التنميط التعبير الجيني. على الرغم من أن فعالة جدا لفحوصات المصب، LCM لا يخلو من القيود. الأولى، LCM هي عملية مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى الطبيعة غير المستقرة من الحمض النووي الريبي، فإنه غالبا ما يشكل تحديا للحصول على جودة عالية الحمض النووي الريبي من عينات LCM 2. نظرا لديsadvantages من LCM، التطورات الجديدة في التكنولوجيا تسليخ مجهري لا تزال هناك حاجة لجعلها في متناول عدد أكبر من الباحثين بطريقة حساسة بأسعار معقولة والوقت.
واحدة من هذه التقدم في التكنولوجيا تسليخ مجهري تتوفر الآن تقنية تعرف باسم mesodissection. في هذا الأسلوب يتم استخدام آلة لطحن قسم الأنسجة المشروح من الاهتمام وحرف هاء قبل أن تتحول إلى استهلاك مطحنة بت 3. المقبل، يمكن أن يستنشق هذه العينة في أنبوب جمع وتستخدم للتطبيقات المصب. مزايا هذا النظام هي أنه أقل تكلفة ووقت حساس. في تجربتنا، ونظام يسمح للتشريح قسم الأنسجة الورم الحبيبي الرئة في عشر دقائق. من ناحية أخرى، فإن LCM التقليدية المرجح أن يتطلب ساعات لإتمام العملية. نظام يسمح للمشغل لتحميل شريحة إشارة إلى استخدام وعلى سبيل المقارنة، وكذلك أداة للالشرح. بالإضافة إلى ذلك يتم إنشاء تقرير يوضح المنطقة (ه) من الشريحة التي تم تشريح. هناك نوعان من عيوب الرئيسي لmesodissection. على الرغم من فعالية في استخراج خلايا متعددة، فإنه يمثل تحديا لعزل خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك، دقة الصورة الناتجة ليست واضحة كما لو باستخدام المجاهر التصوير الأخرى.
السل (TB) هو القاتل الرئيسي الأمراض المعدية الإنسانية في جميع أنحاء العالم والنتائج من الإصابة بفيروس المواضيع المتميزة. في الغالبية العظمى من الأفراد المعرضين لهباء من المواضيع المتميزة، هو عدوى محدودة خفية. في 10 ملايين شخص سنويا على الأقل، فإنه يؤدي إلى مرض السل النشط 4. خلال العدوى الكامنة، ويرد MTB داخل آفات الرئة المرضية المعروفة باسم الأورام الحبيبية. ومن ثم فقد قيل أن نتائج العدوى MTB تقرر على مستوى الورم الحبيبي 5.
نحن هنا لشرح كيف يمكن استخدام mesodissection لmicrodissect حبيبية الناجمة عن المواضيع المتميزة. الشرائح المستخدمةهي من FFPE أنسجة الرئة من المكاك وهو قرد اسيوي المصابة. لغرض هذه المظاهرة، ونحن سوف تشريح حبيبية في مجملها. علينا أن نبرهن أيضا أن الحمض النووي الريبي يمكن استخراجها من النسيج استردادها. ويمكن تطبيق هذه التقنية لعينات الأنسجة من مختلف عينات أخرى ومن ثم تستخدم لمجموعة متنوعة من المقايسات المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesodissection هو الاسلوب الذي يمكن تطبيقه على استخراج الحمض النووي الريبي من الشرائح الآفة المرضية الناجمة عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. بل هو ضرورة أن المستخدم يقيس الصورة ومحاذاة الصورة بشكل صحيح. لتحقيق ذلك، يجب معايرة الصك التالية التوجيهات على برامج التصوير. عن?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه التالية NIH الجوائز / subawards لدعم هذا البحث: R01HL106790، R01HL106790-S1، R01HL106786، R01AI089323، R21AI091457، R21RR026006، P20RR020159، C06RR017563، 8T32OD011124-08، وP51OD011104.
Materials
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
Referenzen
- Fend., F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53(9):666-72. (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection–increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593:54-65. doi: 10.1007/978-0-387-39978-2_6. (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14(6):745-. (2012).
- Fleischmann, R.D., Alland, D., Eisen, J.A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184(19):5479-90. (2002).
- Russell, D.G., Barry 3rd, C.E., Flynn, J.L. Tuberculosis: what we don’t know can, and does, hurt us. Science. 328(5980):852-6. doi: 10.1126/science.1184784. (2010).
- AvanSciBio. Mesodissection of fibrous tissue. <http://avansci-bio.com/uploads/CDP-15_Mesodissection_of_Fibrous_Tissue_Rev_B.pdf> (2013).
- Paige, C., Bishai, W.R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe’s point of view. Cell Microbiol. 12(3):301-9. Epub 2009/12/31. doi: 10.1111/j.1462-5822.2009.01424.x. PubMed PMID: 20039878 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P.J., Doyle, L.A., Blanchard, J.L., Lackner, A.A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207(7):1115-27. doi: 10.1093/infdis/jis778. (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B.G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. 99(12):8330-5. doi: 10.1073/pnas.102055799. (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191(12):3965-80. doi: 10.1128/JB.00064-09. (2009).
- Rohde, K.H., Veiga, D.F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D.G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8(6):e1002769. doi: 10.1371/journal.ppat.1002769. (2012).
- Fontan, P.A., Voskuil, M.I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191(18):5628-33. doi: 10.1128/JB.00510-09. (2009).
- Rustad, T.R., Harrell, M.I., Liao, R., Sherman, D.R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3(1):e1502. doi: 10.1371/journal.pone.0001502. (2008).
