À haut débit d'analyse de l'image de Sphéroïdes tumorales: Une application logicielle conviviale pour mesurer la taille de Sphéroïdes automatiquement et avec précision

SpheroidSizer est conçu pour produire de détection automatique, la délimitation et la mesure des sphéroïdes 3D, avec le travail remarquablement réduites et une efficacité accrue aiguë de grandes quantités d'images. Figure 1A montre le flux de travail de SpheroidSizer. Les étapes de calcul de base comprennent l'initialisation automatique, algorithme de contour actif et le contour quantification. Après calcul automatisé, la fonction de contrôle de qualité utilise une combinaison de "Initialisation manuelle" et des outils "Dessiner à la main" pour sauver une segmentation imparfaite. Figure 1B illustre l'algorithme de contour détaillé automatisé active. L'étape d'initialisation (itération 0) utilise des étapes de base de traitement d'image pour générer la taille et l'emplacement approximatif de la sphéroïde et de générer un contour d'initiation sphérique avec une taille estimée. Le contour de l'ouverture alimente l'algorithme de contour actif. À son tour, il parcourt à ajuster en fonction de l'image localegradient et la forme de courbure. L'algorithme de contour actif se termine lorsque le contour se stabilise (converge), c'est à dire 477 itérations pour cette image, ou lorsque le nombre maximal prédéfini d'itérations a été exécuté. Dans cet exemple, le contour d'initialisation est volontairement élargi pour mieux mettre en valeur l'algorithme. En réalité, l'initialisation est généralement très proche de la frontière réelle et beaucoup moins d'itérations sont nécessaires pour l'algorithme de converger. Par la suite, l'algorithme prend des mesures morphométriques de la frontière sphéroïde détecté. Les axes majeurs et mineurs de l'ellipsoïde sont mesurés en utilisant MATLAB boîte à outils de traitement d'image (figure 1C). L'axe majeur est défini comme étant le segment de droite reliant une seule paire de points les plus éloignés du contour, qui est appelé la longueur (L). Le petit axe est défini comme étant la ligne la plus longue perpendiculaire à l'axe majeur, qui est appelée la largeur (W). Dans ce cas, les valeurs de L et W sont très proches puisque lesphéroïde est sphérique. Le volume de l'ellipsoïde est calculée comme étant V = 0,5 * L * W 2. L'une des caractéristiques est sa SpheroidSizer de détection automatique de la limite des sphéroïdes même sur des images avec un fond irrégulier ou bruyant en utilisant l'algorithme de contour actif (Figures 2B-D). Traitement informatique des images de champ lumineux est souvent minée par un fond inégal, qui égare les méthodes à base de seuillage adaptatifs pour produire des résultats de seuillage indésirables. La question est particulièrement évident lorsque les plaques multi-puits sont utilisés et parois des puits peuvent créer des effets d'ombre sur les images. Cependant, parce que l'algorithme de contour actif n'est pas sensible à l'évolution progressive de l'ombrage en arrière-plan, il est en mesure d'identifier sphéroïde segmentation dans ces images lumineuses sur le terrain avec une bonne initialisation. Figure 2 montre quelques exemples d'images avec un fond inégal ou bruyant, comme inégale illumination (Figure 2B </strong>), les débris (figure 2C) ou noyau nécrotique (figure 2D). Avec l'algorithme de contour actif automatisé, ces sphéroïdes SpheroidSizer délimite avec précision dans tous ces images comme le montre le contour rouge sur le panneau inférieur de chaque figure. La fonction de contrôle de qualité de SpheroidSizer est la clé pour un flux de travail à haut débit. Le "Initialisation manuelle" et des outils "Dessiner à la main» sont les outils complémentaires utiles pour cette application. Parmi des centaines ou des milliers d'images, il est inévitable que l'algorithme automatisé n'est pas capable de détecter correctement les sphéroïdes en quelques images. Comme le montre la figure 3A, lorsque la détection incorrecte du sphéroïde est due à l'étape d'initialisation, soit la taille ou l'emplacement du contour de l'initiation à l'image (en haut) inadéquat, la fonction "Initialisation manuelle" fonctionne en permettant à l'utilisateur de bien définir l'emplacement et la taille de la spheroid manuellement (panneau inférieur). Il déclenche l'algorithme de contour actif pour lancer avec contour défini manuellement et exécuter à converger sur le contour souhaité. Pour ces images difficiles comme l'image originale de la figure 3B, le sphéroïde est situé dans un arrière plan gênant et bruyant. SpheroidSizer n'est pas en mesure d'identifier correctement l'ellipsoïde par la méthode automatisée (en haut) ou par la fonction "Initialisation manuelle" avec une initialisation correcte (panneau du milieu). Dans ce cas, l'outil "Hand Draw" peut être utilisé pour dessiner manuellement le contour de l'ellipsoïde, comme illustré dans le panneau inférieur. Le programme utilise la limite définie par l'utilisateur pour mesurer les axes majeur et mineur de l'ellipsoïde et le calcul du volume. Tous les résultats corrigés sont immédiatement incorporés dans le "Tableau des résultats" et peuvent être exportés en conséquence. Pour déterminer la performance de SpheroidSizer dans de plus grands ensembles de données, on compare d'abord la durée de fonctionnement parl'analyse de la même série de 288 images en utilisant 1) des mesures manuelles avec un microscope fournisseur de logiciel fourni; 2) SpheroidSizer avec un single-core ordinateur portable ordinaire; et 3) SpheroidSizer avec un poste de travail à plusieurs noyaux de la performance de traitement parallèle. Les mesures manuelles suivent notre protocole typique avant de développer le logiciel: la longueur et la largeur de chaque sphéroïde sont dessinés à la main et mesurées en utilisant le programme de fournisseur (comme on le voit les lignes rouges dans le panneau supérieur de la figure 4A); puis l'utilisateur copie vers le bas les valeurs de mesure. SpheroidSizer traite chaque image en générant la limite de sphéroïde (comme le montre le contour rouge dans le panneau inférieur de la figure 4A), la mesure de la longueur axiale majeur et mineur, et exporter les résultats dans les feuilles de calcul. Comme on le voit dans le tableau 1, sur la base du calcul de 288 images, il faut une moyenne de 31.67 secondes pour mesurer un sphéroïde par image manuellement; alors il ne faut SpheroidSizer moins de 2 s & # 160; lors de l'exécution sur un single-core ordinateur portable ordinaire; et moins de 1 seconde lors de l'exécution sur un poste de travail sur le rendement de 12 noyau. Par conséquent, l'analyse de l'image est sur 18x plus rapide par image à l'aide SpheroidSizer de mesures manuelles. Il réduit considérablement le travail lorsque plus de milliers d'images sont analysées. Ensuite, nous comparons la variabilité des mesures des 24 sphéroïdes illustrés à la figure 4A entre les mesures manuelles et SpheroidSizer. Les 24 sphéroïdes sont évalués à trois reprises par les deux méthodes; et l'écart type de chaque sphéroïde individuel est calculée. Comme on le voit sur ​​la figure 4B, l'écart-type de SpheroidSizer (ligne verte et des points) est proche de zéro, sauf pour les trois sphéroïdes qui sont corrigés à l'étape de contrôle de qualité, qui montrent encore plus petit écart-type que ceux de la méthode d'évaluation d'emploi. Tous ceux-ci indiquent que SpheroidSizer effectue l'analyse d'image de manière plus efficace et précise. e_content "> Nous avons effectué un dépistage de drogues en utilisant sphéroïdes BON-1 tumorales 3D humains pour savoir qui des composés en combinaison avec un inhibiteur de Hsp90 sont les candidats potentiels pour tester les effets anti-tumoraux in vivo. sphéroïdes tumoraux BON-1 3D humaines ont été cultivées sur des plaques de 96 puits d'agarose revêtues telles que décrites dans le document précédent 15. huit composés différents avec six dilutions en série ainsi que les médias et les véhicules ont été criblés pour leurs effets uniques et combinatoires avec 10 nM et 20 inhibiteur nM de hsp90 dans les doubles respectivement. Deux sphéroïdes étaient utilisé pour chaque concentration du composé individuel ou les composés associés. Quatre plaques de 96 puits dont le total des 384 sphéroïdes ont été utilisés. Toutes les sphéroïdes ont été imagées à 0, 72, 144, 168, et 192 heures. Un total de 1920 images ont été produites à partir de cette expérience. SpheroidSizer Il a fallu seulement 30 min pour terminer l'analyse informatique des images 1920 avec un 50 minutes supplémentaires pour le contrôle de la qualité et de l'exportation de données. SphéroidSizer accélère le processus d'analyse d'image énormément. figure 5A montre une capture d'écran des arrangements de dossier et les noms de fichiers pour cette expérience comme un exemple pour le protocole étape 3.3. Figures 5B-E montre les captures d'écran de l'analyse d'image des fenêtres pop-up et les résultats . utilisant SpheroidSizer comme illustrations pour le protocole étapes 4, 5 et 7 Prendre les volumes des sphéroïdes 3D à partir de la table de résultats formaté exportés de SpheroidSizer, nous avons fait des graphiques – croissance de sphéroïdes tumoraux 3D sur des traitements composés en fonction du temps de traitement. Deux graphes représentatifs de cette expérience sont présentés dans la figure 5F et 5G. La figure 5F montre que les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et de la cladribine (ligne verte) inhibent la croissance de 3D sphéroïdes plus que le seul traitement de l'inhibiteur de la hsp90 (ligne violette) ou la cladribine (ligne orange), ce qui suggère que les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et cladribine peut avoir des ef anti-tumoralfets in vivo. Figure 5G montre que les traitements combinés de l'inhibiteur de Hsp90 et adriamycine (ligne verte) n'inhibe pas la croissance de la 3D sphéroïdes plus que le seul traitement de l'adriamycine (ligne orange) ou un inhibiteur de Hsp90 (ligne violette), ce qui suggère que la les traitements combinés de l'inhibiteur de la hsp90 et de l'adriamycine peuvent ne pas avoir des effets anti-tumoraux in vivo. Cette expérience nous a permis de mieux sélectionner les composés à tester leurs effets anti-tumoraux in vivo et SpheroidSizer est la clé de l'analyse des données expérimentales rapide. Tableau 1. Comparaison de la durée de fonctionnement sur ​​l'analyse de l'image entre des mesures manuelles et SpheroidSizer lorsque l'on analyse le même jeu d'images 288. S'il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette table. Figure 1 SpheroidSizer -… Un logiciel open-source pour mesurer la taille de l'ellipsoïde A) Le noyau flux de travail de l'application B) Illustration de l'algorithme de contour actif à différents stades de l'itération. S'il vous plaît noter que le contour d'initialisation (itération 0) a été délibérément agrandi afin de présenter l'algorithme. C) Les majeurs et mineurs des mesures de longueur axiale et le calcul du volume par SpheroidSizer. L – axe majeur: le segment de droite reliant une seule paire de points les plus éloignés du contour (appelée longueur); W – petit axe: la ligne la plus longue perpendiculaire à l'axe principal (ci-largeur). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> Figure 2. Des résultats représentatifs de la segmentation automatique des SpheroidSizer, montrant la robustesse contre les diverses conditions de l'image. A) des images de bonne qualité typique. B) Images avec la luminosité et le contraste différent. C) Images avec des débris de distraction. D) Images de sphéroïdes avec noyau nécrotique . Images à la face supérieure de chaque figure sont les sources / images originales; des images sur le panneau inférieur de chaque figure sont les images de contrôle de qualité; et le contour rouge est la segmentation du sphéroïde dessinée par calcul automatisé. hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51639/51639fig3.jpg "/> Figure 3. Illustration de la "Initialisation manuelle" et "main dessiner" des outils. A) L'outil «Manuel d'initialisation" permet le dessin d'une forme d'ellipse de montage à travers le sphéroïde pour l'initialisation, quand inexactes sphéroïde segmentation se produit après l'initialisation automatique. B ) L'outil "main tirage" permet dessin à la main précise de la frontière sphéroïde, quand segmentations sphéroïde inexactes se produisent avec l'initialisation à la fois automatique et manuel. La ligne bleue autour du sphéroïde montre le contour d'initialisation; le contour rouge est la limite sphéroïde identifié. S'il vous plaît noter que le sphéroïde dans "Initialisation manuelle" en A) et le sphéroïde dans "Hand Draw" en B) est volontairement élargi pour mieux mettre en valeur les outils. <img alt="Figure 4" fo:content-width = "5 po" fo: src = "/ files/ftp_upload/51639/51639fig4highres.jpg" "> Figure 4. Comparaison de l'image des performances d'analyse entre SpheroidSizer et mesures manuelles lors de l'analyse de la même série de 24 images. A) sphéroïdes représentatifs pour montrer comment la longueur et la largeur de sphéroïdes sont déterminées par des mesures manuelles et SpheroidSizer. Top 24 images contiennent dessinées à la main longueur / largeur de chaque sphéroïde lignes rouges à l'aide de mesures manuelles; inférieurs de 24 images (les mêmes 24 images) contiennent sphéroïde frontière tracée par ordinateur en utilisant le contour rouge SpheroidSizer. B) Ecart type de longueur ou de la largeur de trois mesures sur chaque sphéroïde individu. Figure 5. Un exemple représentatif de l'utilisation de sphéroïdeSizer dans l'écran de la drogue – l'analyse d'image sur les images des sphéroïdes qui ont été recueillies à partir d'un écran de drogue en utilisant sphéroïdes tumoraux BON-1 3D A) Une capture d'écran du régime de dossiers et de fichiers de ce projet B) Une capture d'écran de la pointe.. fenêtre configurations dans SpheroidSizer. C) Une capture d'écran de la fenêtre SpheroidSizer1.0 avec les résultats affichés tableau. D) Une capture d'écran du fichier de sortie de format d'exportation de SpheroidSizer. E) Une capture d'écran du fichier de sortie de liste exportée de SpheroidSizer. F) La croissance des sphéroïdes tumoraux 3D sur les traitements avec un inhibiteur de Hsp90 et la cladribine. G) Croissance des sphéroïdes tumoraux 3D sur les traitements avec un inhibiteur de Hsp90 et adriamycine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </p>