Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em> Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için> merozoitler

Not: Bütün safhalar, santrifüjleme ve akış sitometrisi yanı sıra, sterilliği korumak için, bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır. Uygun önlemler insan örneklerinin kullanımı ile ilgili alınmış olduğundan emin olun. Deney Plazma küçük miktarlarda için çok hassastır. % 78 Papua Yeni Gine (PNG) yarı-immün çocukların plazma – Resim seyreltileri 5 arasında değişen tepkileri çözmek için en uygunudur. En uygun seyreltme plazma setleri, test edilen bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, plazma, her uygulama için deneysel koşullar elde etmek için titre edilmesi önerilir. Plazma yokluğunda merozoit 2 negatif kontrol THP-1 hücreleri, ilave edilmesini temin etmek; ve merozoit ile THP-1 hücreleri, sıtma naif bireylerden plazma bir havuzu ile opsonize. Bu THP-1 hücreleri merozoit bağlılık için kontrolü sağlayacak ve fagositoz olayların titiz akım sitometri yolluk etkinleştirmek için. PNG plazma örneklerinin kullanımı olduTıbbi Araştırmalar Danışma Kurulu, Sağlık Papua Yeni Gine Bakanlığı, Walter ve Eliza Hall Institute Etik Kurulu (proje numarası 04/04) tarafından onaylanmıştır. Yazılı izin tüm katılımcıların anne / veliler elde edilmiştir. 1.. THP-1 Kültür % 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1 ortamı) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortam maddesi içinde ve 37 ° C 'de, insan monositik hücre hattı THP-1 koruyun. 5 x 10 5 hücre / ml 'nin altındaki bir yoğunlukta hücreler koruyun. Not: Fazla büyüme yapışık hücreler içine aşağı-regülasyonu Fc reseptörleri farklılaşması ile sonuçlanır. Hücreler, yaklaşık 10 kez daha pasajlama edildikten sonra, hücre fenotipi korumak için yeni bir şişe eritin. 2.. Antikor Numune Hazırlama ve seyreltme Isı etkisizleştirilmiş plazma 56 ° C'de inkübe tarafından test edilmiş ve sıtma görmemiş kontrol plazma edilecek, 30 dakika boyunca C Seri olarak THP-1 ortamı içinde 1/2, 000 plazma örnekleri seyreltin. -20 ° C'de saklayın seyreltilmiş plazma Yüksek Senkronize P. 3. Kültür falciparum Not: GFP-ifade parazit hattı D10-27 PfPHG nedeniyle parazitlerin senkronizasyon ve E64 Eklemenin zamanlaması kontrol edilen yardımcı olarak 48 saat yaşam döngüsü için kullanılmıştır. Bu hat sitosolde GFP ifade çünkü Dahası, bu hat GFP akış sitometri tespiti tarafından parasitaemia ve ücretsiz merozoit algılanmasını sağlar. Bununla birlikte, GFP floresan yoğunluğu THP-1 hücreleri içinde görüntülenmesini sağlamak için yeterli değildir ve bu nedenle, merozoites Etidyum bromür (EtBr) ile karşı edilir. Diğer suşlar parazit sıkı senkron başarılabilir koşuluyla kullanılabilir. Invazyon 15 inhibe etmek için olgun formları 28 ve heparin parçalamak için sorbitol tedavinin bir kombinasyonu kullanılarak parazitler senkronize </skadar>. P ismi koruyun falciparum RPMI-1640 ortamı içinde% 3 hematokrit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin,% 10 toplanmış insan serumu, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ile desteklenmiş (pH 7.4), O + insan eritrositleri (RBC) olarak parazitleri ve 20 ug / ml gentamisin (Parazit ortamı). GFP + parazitler için seçmek üzere kültür ortamına 5 mg / ml Blasticidin-S hidroklorid ekleyin. % 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C 'de hava geçirmez kutu veya alternatif olarak çift kapalı kültür şişelerinde kültürleri inkübe edin. , Ince bir tabaka slaytlar Hazırlama 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 6.7 mM (pH 7.1) paraziteminin izlemek için 10 dakika boyunca fosfat tamponu (Giemsa çözeltisi) içinde% 10 Giemsa çözeltisi ile lekesi. Boyama sonra, su ve hava-kuru olarak slayt durulayın. Bir 100X immersiyon yağı lens kullanarak paraziteminin değerlendirin. Kültürleri bölme ve bulaşmamış ekleyerek% 5 enfekte RBC altında bir parazitemya az parazit kültürleri korumakRBC gerektiği gibi. Heparin ile senkronize etmek için, kültürleri aşamalı halka tıbbi dereceli heparin 20 IU / ml ekleyin. Parazitlerin çoğunluğu şizont aşamasında olduğunda, 5 dakika boyunca 300 x g'de topak hücreleri şizont yırtılması ve merozoit işgali izin vermek için bir parazit ortamında heparin içeren ortam ve tekrar süspansiyon çıkarın. 4 saat sonra, başka merozoit istilasını engelleyerek, geri kültürlere 20 IU / ml heparin ekleyin. Not: parazitler yeterince senkronize önce sorbitol ve heparin tedavi birkaç devir gerekli olabilir. % 5 parasitaemia – merozoit uygun numaraları oluşturmak için, 3 de parazit kültürünün 150 ml hazırlamak. Geç Sahne P. 4. İzolasyonu falciparum trophozoit Otuz altı saat kültürlere heparin döndükten sonra, 5 dakika boyunca 300 xg'de kültürlenmiş hücreler pelet, ve% 25 hematokrit parazit ortam içinde tekrar süspansiyon pelet. Geniş bir manyetik kolonu (6.3 matris hacmi takınmi) bir mıknatıs, ve tüm hava kabarcıkları bertaraf edilmiştir emin, parazit ortamı ile sütun dengeye getirin. Yeniden süspansiyon haline P. ekleme falciparum kültürü, kolona ve saniyede bir damlasına akış hızını ayarlayın. Kültür kolonundan geçtikten sonra akış ile net bitene kadar, parazit ortamı ile sütun yıkayın. 37 ° C parazit ortamında 30 ml kolondan parazitleri Zehir. , Parazitler bir ince bir tabaka hazırlanması 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 3 dakika boyunca Giemsa çözeltisi ile leke. Mikroskop altında slayt inceleyin ve parazitler neredeyse kırmızı kan hücresi, dolgu ve erken şizont dönemlerinde olduğu görünmesini sağlamak. Parazitler, uygun olgunlaşma aşamaya varsa uygun geliştirilmiş kadar,% 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C inkübatör saflaştırılmış parazitler döndürür. Not:% 90 daha enfekte kırmızı kan hücrelerinin saflığı R sağlamak için gerekli olanBCs merozoit hazırlıklarını kontamine yok. . 10. mcM E64 6 (epoksisukini-L-ösi (4-ganidino) bütan (E64) ile izole schizontsun davranın – 10 saat NOT: E64 ile uzun inkübasyon süreleri mümkündür, ancak üretilen merozoites artık invaziv olacaktır. P. 5. Izolasyonu falciparum merozoites E64 ile inkübasyondan sonra,% 100 metanol hücreleri düzeltmek ve zar-kapalı merozoit oluşumunu değerlendirmek için Giemsa çözeltisi ile leke, parazitler smear. NOT: parazitlerin% 50'den daha fazla zar içine merozoitler meydana varsa merozoit iyi bir verim elde edilir. Pellet 8 dakika boyunca 1900 x g'de schizontsun E64-işlemden geçirildi. Kalan insan serumu çıkarmak için RT RPMI-1640 ortamında, 50 ml 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ve 20 ug / ml gentamisin (yıkama ortamının) ile takviye edilmiş (pH 7.4) ile yıkayın . Yıkama ortamının 2 ml pelletini. NOT: THP-1 ortam FCS içeren kullanma filtrasyon sırasında frothing üretecek. 1.2 μm/32 mm şırınga filtresi üzerinden yeniden süspansiyon haline getirilmiş E64-schizontsun 2 ml filtre. Bir 10 ml tüp içinde süzüntüyü toplayın. Not: Süzülen filtresinde un-rüptüre schizontsun ve moloz, merozoitler ve hemozoin kristalleri içerir. Bir mıknatıs, küçük bir manyetik sütun takın ve 500 ul THP-1 ortam ile dengelenmesi. Manyetik sütunu üzerinde filtrat geçirin. Flow-through toplayın. Not: merozoites geçecek ise Hemozoin, kolona bağlanacaktır. Her bir zaman içinde akışı toplamak, hemozoin kaldırmak için sütun iki kez daha fazla akım geçer. Kalan merozoitler toplamak için RT THP-1 ortam 2 ml ile sütun durulayın. 10 ug / ml (son konsantrasyon) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekesine EtBr ekleyin. Photobleaching önlemek için ışıktan korumak. Not: emin olun hepsi EtBr kirlenmiş sıvı ve pLastic atık sitotoksik kimyasalların uygun bir şekilde bertaraf edilir. Bu merozoitler, inkübasyonu takiben artık invaziv vardır. 10 dakika boyunca 4.000 xg'de merozoites aşağı spin. Uygun bir atık kabı içine süpernatant atın. 4 ml THP-1 ortamında merozoit pelletini ve 10 dakika boyunca 4.000 xg'de aşağı doğru döndürün. 15 ml'lik bir hacme kadar THP-1 orta toplayın ve ışıktan koruyunuz. Sitometrisi 6. Nicel Merozoit Konsantrasyon Oda sıcaklığına kadar boncuk sayma getirin. Merozoitler seyreltmek için% 0.5 BSA ile PBS hazırlayın. 3 seyreltilerde merozoitler Toplamı; 100'de 1; 1, 50 ve 25 1., Sırasıyla, PBS +% 0.5 BSA içinde 940, 930 ve 910 ul 3 FACS tüpü hazırlayın. Sırasıyla, tüp başına saflaştırılmış merozoit 10, 20 ve 40 ul ekle. 30 saniye vorteksleyin sayma boncuklar, ve sulandırılmış merozoitler içeren FACS tüp başına, boncuk tanelerin 50 ul ekle. Üç sey çalıştırınBir akış usulünde merozoit örnekleri sitometresiyle 488 nm lazer ile donatılmış. Ayrı bir kanal floresan tarafından EtBr ve GFP floresan çift floresan dayalı merozoit ve kapı sayma boncuk için sıkı bir kapı ayarlayın. 2000 boncuk toplanana kadar olayları edinin. Not: Bu talimatlar EtBr ile karşı lekelenmiş olan GFP + merozoites sayma bakın. Sonra yan dağılım ve EtBr floresan dayalı merozoit kapıları ayarlamak parazitleri ifade GFP kullanan değilse. Merozoit oranını belirleyin: 2.000 sayma boncuk olaylar merozoit olayların sayısına bölünmesiyle boncuk, her seyreltme için bir oranını hesaplamak. Tüp başına eklenmiş boncukların 50 ul boncuk sayısını belirlemek için sayma boncuk yığın özelliklerini kullanarak. Seyreltme faktörü ile ve merozoit 50 ul boncuk sayısını çarpın: bu seyreltme faktörü boncuk oranına sahiptir. Bu sayı, ml başına merozoit konsantrasyonuna eşittir. Inci gerçekleştirinHer seyreltme için adımlar ese. Üç eriyiğinin boyunca ölçülen merozoit konsantrasyonları ortalama. 50 yılında 100, 1 1 için belirlenen konsantrasyonları için% 10 aşan standart sapmaları ve 1 25 sulandırmalar sayım numune hazırlamada teknik yanlışlıklar gösterir: NOT. THP-1 hücre başına dört merozoit nihai bir oran sağlamak için, THP-1 ortamı içinde 8 x 10 6 merozoites / ml 'de yeniden süspanse merozoitler. THP-1 oranlarına diğer merozoit kullanılabilir ve buna göre konsantrasyonları modifiye edilmelidir: NOT. 7. Fagositoz Assay 96 U-alt plakaların kuyu başına ısı inaktif FCS 200 ul ekleyin ve plakaları engellemek için RT O / N bırakın. İnkübasyondan sonra, FCS çıkarın ve 200 ul steril PBS ile iki kez kuyu yıkayın. Kullanılana kadar 4 ° C de PBS ve mağaza plakaları çıkarın. 1 x 10 ° numune için triplikat kuyu sağlayan, plazma örnekleri ve kontrol test etmek için gerekli olan THP-1 hücre sayısını hesaplayın <sup> 5 THP-1 hücreleri, oyuk başına. Bir hemositometre slayta kültürün 10 ul yükleyerek THP-1 kültür konsantrasyonunu belirleyin. Mikroskop altında haemocytometer 16 köşe kareler 4 set mevcut hücrelerin sayısını sayar ve ardından ortalama sayımları. Ml başına hücre sayısını hesaplamak için 10,000 ile ortalama sayısını çarpın. 5 dakika boyunca 500 xg'de THP-1 hücrelerinin gerekli sayıda Spin ve THP-1 ortamı içinde 6.7 x 10 5 hücre / ml 'de tekrar süspansiyon haline getirin. 10 5 hücre / göz ile sonuçlanan bir FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka için oyuk başına THP-1 ortamı içinde THP-1 hücrelerinin 150 ul ekle. Test edilecek numune başına 3 kuyu hazırlayın. Merozoites eklemek için hazır olana kadar inkübatör için plaka dönüş. De ayrı FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka 8 x 10 6 / ml başına en merozoit hazırlanması 150 ul ekle. Test numune başına bir kuyu hazırlayın T, oyuk başına hazırlanmış seyreltilmiş plazma örnekleri 10 ul ekleo merozoites içeren plaka ve homojen bir çözüm sağlamak için iyice karıştırın. Inkübatör THP-1 plaka çıkarın ve plazma, numune başına üç kopya halindeki gözlerin, iyi THP-1 hücreleri içeren her merozoit / plazma çözeltisi 50 ul ekle. İyice karıştırın ve% 5 CO2, 40 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Işıktan korumak için folyo ile örtün. 40 dak, 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri fagositoz durdurmak için santrifüj önceden soğutulmuş sonra. Süpernatantı, ve buz gibi soğuk PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS tamponu) ile iki kez yıkama hücreleri. Not: EDTA akış sitometri analizi için tek bir hücre süspansiyonu korunmasında kolaylaştıracaktır. PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS sabitleyici) içinde% 2 paraformaldehit (PFA) 90 ul, hücreler. Işıktan korunmalıdır edinimi, kadar buz üzerinde bırakın. 8. Sitometrisi Donanımlı wi akış sitometresiyle örnekleri Edinme488 nm lazer ve yüksek kapasiteli plaka okuyucu eki inci. NOT: Bu bir merozoit hazırlanmasından test edilecek 400 plazma örneklerinde kadar sağlayacaktır. Hücreler, aynı zamanda el ile örnek yükleme için tüplere transfer edilebilir. Ileri ve yan dağılım tarafından Kapısı canlı THP-1 hücreleri. Kontrol 'merozoit ve hiçbir plazma ile THP-1 hücrelerinde' dayalı EtBr olumlu kapıyı ayarlayın. Örnek başına 10.000 olayların en az edinin. 9. Veri Analizi Analiz yazılımı akım sitometri ve EtBr olumlu olaylar için sıkı kapıları ayarlamak kullanarak verileri analiz. Immün olmayan bir plazmadan ile örnek eksi% pozitif hücreler için EtBr + hücrelerin%: Her numune için yüzde fagositoz hesaplayın. Kopyalardaki genelinde ortalama sonuçları. NOT:% 10 aşan bir üçlü için standart sapmalar deneysel yanlışlıklar göstermektedir. Bazı arka EtBr pozitif olaylar merozoi bir sonucu olarak gözlenebilirte THP-1 hücrelerinin yüzeyine yapışma fakat merozoitler içeren tüm numuneler arasında tutarlı olmalıdır. Daha sonra denetim 'THP-1 merozoit ve herhangi bir plazma ile hücreler', ve kontrol 'non-immün plazma ile THP-1 hücre' içinde herhangi bir arka plan çıkarılması göre kapı ayarlama nedeniyle içsel için floresan yansıtan% fagositoz neden olur / Sadece merozoites fagosite.