ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

1。タングステン針を準備ロッドが曲がらないようにワイヤーカッターを使用して半分にタングステン棒をカット。 ホウケイ酸ガラスパスツールピペットで5 3/4のテーパ端部を通って棒を通します。 グルーガンに使用スティックのりである、「ホットメルト接着剤」（HMA）の小さなビーズをピペットチップに棒を接着し、ガラスから突き出ロッドの約3/4が残る。 HMAはすぐに接着剤を燃やすと黒煙を発生しないように注意しながら、アルコールの炎で溶融されるべきである。 ピンセットを用いて、45°の角度に到達するまで（約1/4の上端から内）タングステン棒の先端を曲げる。 パスツールピペットを保持して、プロパントーチの炎にタングステン棒の先端の約1/8を配置します。安定した炎に正確に垂直先端を保持します。 炎の外に針を引く瞬間tungsの小さなオレンジ色の斑点針のオフ10ハエ。 2。シュペーマンピペットを準備まもなくテーパーを超えて、ガラスが溶け始めるまでブンゼンバーナーを使用して、パスツールピペットの狭い方の端を加熱する。炎から取り外し、ピペットがシールになるまで先端を引っ張る。約0.7〜1.0ミリメートルのODを持つテーパ部の一部が残っていることを確認してください。密封端先細りから約4cmを破る。 ピペットの広い（開放）最後にゴム管の周囲に2フィート（60センチメートル）を取り付けます。空気がパスツールピペットのテーパ部を通過しないことを保証するためにゴム管のもう一方の端に吹く。 付属の鉛筆火炎トーチとプロパン燃料ボンベを使用して、単にテーパーの開始以下のピペットの片側に楕円形の領域を加熱。圧力のわずかな量（レットの始まりと言うのに必要な圧力の約量のゴム管を通じて非常に優しく、常に空気を吹き込むR会話レベルでの「P」）。ガラスが一面に柔らかくなり、外側にバックルを開始すると、すぐに炎からピペットを取り外し、ゴム管を通じてハードと着実に吹く。これは、ガラスの加熱部分がうまくなる、ポップもソーセージ形の泡を形成するようになります。気泡が小さすぎると、再びガラスを溶融し、発泡試みる。ガラスの最後の開いているウィンドウは、長い（12.7ミリメートル）での0.5により、広い周囲の0.25（6.35ミリメートル）である必要があります。 穏やかにピペットに入るのガラス破片を防ぐためにチューブを通して吹き込みつつ上方にテーパ状端部を指し、ガラス廃棄物容器内に泡を掻き取る。 プロパン炎を使用して、バブルと火 – ポーランド開いているウィンドウの辺の残りのエッジを燃焼。ピペットのシャフトを溶融しないように注意してください。 ダイヤモンドポイントの鉛筆を使用して、ウィンドウから約1.25（30ミリメートル）でのピペットのテーパー端をスコアチップを解消鉗子でピペット開口部はきれいにカットされているように（破線や凹凸ヒントを廃棄ピペット）。 ときに窓開口屈曲部が垂直面内にあるように、鉗子およびアルコールバーナーからの火炎の縁部を用いて、約60°の角度に先端から（9.5 mm）の中にピペット0.375の狭い部分を曲げる左利きの使用のために右利きの使用状況と午前11時のため一時位置にある。このステップは、最高のドラフトのない筐体で行われる。 解剖顕微鏡下でのアルコールの炎を使って火ポリッシュ先端。先端を閉鎖するのではなく円形の開口を維持し、任意のくびれのない滑らかなしないようにしてください。 、ゴム管の中の1（25ミリメートル）の部分をカットし、70％エタノールでチューブの一部をスプレーして、窓の開口部が完全に覆われるまで、ピペットのシャフトの上にチューブをスライドさせます。これはシュペーマンピペットの「ダイアフラム」として機能する。 ラテックスゴム2ミリリットルの電球を配置ピペットの開放底部の上。電球はシュペーマンピペット内の負圧を維持している。 、シュペーマンピペットを使用して練習し、顕微鏡下で、別の著しい場所に1シャーレの著しい箇所から、直径で約100〜200ミクロンのクロマトグラフィービーズを転送します。 シュペーマンピペットを洗浄するために、底に綿やガーゼを敷いた、蒸留水やガラス製品の洗浄剤で満たされた背の高いビーカーに、先端を下に、ゴム球と場所ピペットを削除します。 3。卵を殺菌しインキュベート 70％エタノールで卵を拭くとプラスチックの卵トレイに卵を置きます。 37.5℃、85から87までパーセントで加熱されたインキュベーター内で卵を設定します。 彼らはHH9.5、ウズラやアヒルのために48時間、約26時間後に到達するまで卵をインキュベートする。 4。ウィンドウ卵内殻Mを穿刺しないように注意しながら、ピンセットで卵の上から外殻の小片を取り除くembrane。 1インチの針で18 gの注射器を用いて、卵の狭い先端の穴を突くと卵白の約1〜2ミリリットル撤回。 殻に穴穿刺マークの上に透明のテープを配置。 湾曲したハサミを使って（透明テープを介して）卵の上面に沿って「窓」を切った。 5。胚を視覚化し、手術のための準備ガラス棒を用いて、胚の上に静かにニュートラルレッドを少量（ハンクスBSS 0.02グラム/ ml）を磨く。 卵黄膜を切断して、火炎シャープタングステン針を使用して、胚の上に引き出します。 ウィンドウの上に透明テープを配置することにより、卵を再密封する。 6。ドナー胚からドナー組織を分離ドナー胚の卵の窓からテープを外します。 ドナー胚の隣接する外胚葉から神経倍をカットするには、両方のSIDにスリットを作る（上記のように製造された）難鋭利なタングステン針を使用して、神経管のエス。 その後、移植片の所望の前方および後方のレベルで神経管を横断し、神経管の他の部分から移植片を分離する。 シュペーマンピペットまたはマイクロピペットの他のタイプのいずれかを使用して、ドナー胚から神経倍に削除します。 そして、ホスト卵に窓に貼ったテープをはがし、移植を受ける神経管の領域に隣接する宿主胚と一緒にドナー神経フォールドを配置するシュペーマンピペットを使用しています。 7。ホスト組織を分離し、ドナー組織を移植ドナーで行ったように、宿主胚の神経管から神経倍に分離する。ドナー組織として同じサイズの移植片を除去するように注意してください。 そっと遠く胚からこの宿主組織を押してください。 その後、鈍いタングステン針またはMIの丸いチップでcropipetteは、静かに、適切な前後方向と背腹方向を維持し、ホストの神経管に折りたたまドナー神経を移動します。移植片が側面に沿って中に隠れていることを確認してくださいますが、突くまたは下層組織に損傷しないようにしてください。元の位置のノートの中性赤からドナー組織または差動染色における任意の非対称性を追跡するのに役立ちます。我々はまた、フォトドキュメント伴う切除した組織とドナー胚と同様に、キメラはすぐに手術後。 宿主胚は、乾燥の兆候を示している場合に滅菌生理食塩水、卵を追加する必要があります。 今、慎重に再シールと卵にラベルを付け、ゆっくりキメラ胚を分析のために必要な段階に開発することができ、高湿インキュベーター（百分の70から80）に戻します。 キメラの8。コレクション作りたての寒セラの固定液にキメラ胚を収集し、すぐにROにそれらを配置することを確認してくださいO / N固定のため4℃でcker。これは、抗ウズラ抗体とウズラ細胞のより高感度な検出を可能にする。 遺伝子発現は、RT-qPCRを介して分析のために、RNA抽出前に液体窒素で直接胚を凍結する。