De dos fotones<em> In vivo</em> Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
En la corteza de los mamíferos, las neuronas forman redes muy complicadas y el intercambio de información en las sinapsis. Los cambios en la fuerza sináptica, así como la adición / eliminación de sinapsis, se producen de una manera dependiente de la experiencia, que proporciona la base estructural de la plasticidad neuronal. Como componentes postsinápticos de las sinapsis excitatorias más en la corteza, las espinas dendríticas se considera que son un buen indicador de las sinapsis. Tomando ventajas de la genética del ratón y técnicas de marcaje fluorescente, neuronas individuales y de sus estructuras sinápticas pueden ser etiquetados en el cerebro intacto. Aquí presentamos un protocolo de imágenes transcraneal utilizando dos fotones microscopía de escaneo láser para seguir la etiqueta fluorescente espinas dendríticas postsináptica a través del tiempo en vivo. Este protocolo utiliza una preparación de cráneo adelgazado, que mantiene el cráneo intacto y evita efectos inflamatorios causados por la exposición de las meninges y la corteza. Por lo tanto, las imágenes pueden ser adquiridas inmediatamente después dose realiza rgery. El procedimiento experimental se puede realizar de forma repetitiva durante diversos intervalos de tiempo que van desde horas hasta años. La aplicación de esta preparación también se puede ampliar para investigar diferentes regiones y capas corticales, así como otros tipos de células, en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
La corteza de los mamíferos participa en muchas funciones cerebrales, de la percepción sensorial y el movimiento de control de abstraer el procesamiento de información y la cognición. Varias funciones corticales se basan en diferentes circuitos neuronales, que se componen de diferentes tipos de neuronas que se comunican e intercambian información en las sinapsis individuales. La estructura y la función de las sinapsis están siendo modificados constantemente en respuesta a las experiencias y patologías. En el cerebro maduro, la plasticidad sináptica toma la forma de ambos cambios de resistencia y la adición / eliminación de sinapsis, que juega un papel importante en la formación y mantenimiento de un circuito neuronal funcional. Las espinas dendríticas son los componentes postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitadoras en el cerebro de los mamíferos. La constante rotación y los cambios morfológicos de las espinas se cree que servirá como un buen indicador de las modificaciones en las conexiones sinápticas 1-7.
Dos fotones de escaneo láser microscopy ofrece una penetración profunda a través, preparaciones opacas gruesas y baja fototoxicidad, que lo hace adecuado para las imágenes en directo en el cerebro intacto 8. En combinación con marcaje fluorescente, dos fotones de imágenes proporciona una poderosa herramienta para mirar en el cerebro vivo y siga reorganización estructural en las sinapsis individuales con alta resolución espacial y temporal. Varios métodos han sido utilizados para preparar los ratones para formación de imágenes en vivo 9-13. Aquí se describe una preparación de cráneo adelgazado de imágenes in vivo de dos fotones para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas postsinápticos en la corteza del ratón. Con este enfoque, los estudios recientes han representado una imagen dinámica de los cambios de la espina dendrítica en respuesta a las habilidades motoras de aprendizaje Con el aumento de la disponibilidad de animales transgénicos con subconjuntos neuronales marcados con fluorescencia y el rápido desarrollo de las técnicas in vivo de etiquetado, los procedimientos similares a los descritos aquí se pueden aplicar también de investigaciónTE otros tipos de células y regiones corticales, en combinación con otras manipulaciones, así como se utiliza en modelos de enfermedad 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para obtener una exitosa preparación de calavera adelgazado, varios pasos de este protocolo son cruciales. 1) El espesor del cráneo. El hueso craneal tiene una estructura de sándwich, con dos capas de hueso compacto de alta densidad y una capa intermedia de hueso esponjoso de baja densidad. Mientras que el micro taladro de alta velocidad es adecuado para la eliminación de las capas externas de hueso compacto y el hueso esponjoso, la cuchilla microquirúrgica es ideal para el adelgazamiento de la capa interior de hue…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a James Perna para la ilustración gráfica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental a YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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