Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d'anticorps synthétiques phage

Avec le début de l'ère post-génomique, la disponibilité des réactifs de liaison de haute qualité pour caractériser et de moduler les protéines est essentiel pour ouvrir de nouvelles recherches et avenues thérapeutiques. Anticorps continuent d'être critique à la fois aux chercheurs universitaires et industriels que la recherche fondamentale et outils de diagnostic et thérapeutiques potentiels. Sans surprise, il ya eu une croissance impressionnante des entreprises de développement d'anticorps du contrat, dont la plupart se appuient sur des technologies classiques d'hybridomes pour générer des anticorps personnalisés. Néanmoins, la sélection in vitro en utilisant des bibliothèques d'anticorps phages devient une technologie alternative puissante qui peut offrir des avantages et des succès uniques où les technologies conventionnelles peuvent rencontrer des limitations ^{1, 2.}

À la lumière de la demande considérable pour les anticorps de haute qualité comme outils de recherche, deux principaux défis pour générer des anticorps renouvelables sont 1) le débit de sélection et 2) l'antigène availability. Un certain nombre de groupes ont maintenant décrit dans les pipelines de sélection in vitro visant à augmenter le débit et le taux de l'identification d'anticorps. Ces descriptions en détail une variété d'approches viables qui incluent le choix soit sur ​​toute la longueur cible ^{3,4, 5,6,7} ou des domaines structurellement liée, en utilisant soit ^6,8 ou une plaque à base de ^3,4 régimes antigène d'immobilisation sur la base de perles. En outre, l'adoption croissante des technologies de synthèse de gènes ^neuf a fait la production de l'antigène systématique, en particulier des domaines isolés, raisonnablement rentable et peut potentiellement atténuer la difficulté d'obtenir des quantités suffisantes de l'antigène purifié, pleine longueur. En utilisant les deux technologies en tandem, un pipeline autonome et la production de l'antigène évolutive et la sélection d'anticorps a été conçu qui permettrait l'isolement d'anticorps parallèle pour les grands ensembles de domaines antigène exprimé et faciliter le développement de réactifs pour characterizing classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement liés.

Vers cet objectif, un pipeline intégré que les couples dans l'identification in silico de domaines d'antigène exprimables, synthèse de gènes, expression bactérienne à haut débit des antigènes et des sélections d'anticorps de phages évolutives a été développé. Ce pipeline ne nécessite que l'infrastructure de base disponible pour la plupart des laboratoires de sciences de la vie (y compris les bibliothèques d'anticorps qui sont de plus en plus disponible via une licence ou un accord de transfert de matériel), mais est également prête à l'automatisation pour une utilisation à l'échelle industrielle. En utilisant ce protocole, il est possible de générer des centaines de domaines d'antigène étiqueté par affinité, et d'isoler des fragments d'anticorps habituellement hautement spécifiques à un grand nombre de ces antigènes.

La technologie de présentation de phage a montré la compatibilité démontrée avec une grande variété de formats de réactifs d'affinité recombinants, y compris les fragments Fab, scFv, Fv et des domaines autonomes et unnombre croissant de petites «cadres alternatifs» (protéines de répétition ankyrine conçus (DARPINS), fibronectine (Fn), domaines de LIPOCALINE et plus ^10). Discussion est limité dans cet exemple à l'isolement de fragments d'anticorps Fab, même si on suppose ces procédés peuvent être adaptés à d'autres types de bibliothèques. En utilisant cette technologie, Fab ayant un faible nanomolaire affinité à petit, tagged domaines de protéines y compris des domaines de facteurs de transcription, des domaines SH2, de l'ARN des protéines de liaison et d'autres ont été sélectionnés avec succès, dont plusieurs se lient protéine de pleine longueur et sont fonctionnels dans des analyses immunologiques telles que l'immunofluorescence , immunoprécipitation et immunohistochimie. Fait important, les clones de liaison recombinantes sont entièrement renouvelables et peuvent être re-générés à partir de constructions d'expression via bactérienne offre de production accrue cohérence, la reproductibilité et la rentabilité, justifiant ainsi la charge de la validation de clone rigoureuse.

Dans cette protocol et vidéo qui l'accompagne, les méthodes de base pour la sélection d'anticorps à partir de banques de phages en utilisant les domaines d'antigènes immobilisés sont démontrés. Cette méthode particulière emploie domaines protéiques étiquetée GST immobilisées par adsorption passive dans des plaques de microtitration, bien que d'autres mots-clés ^11,12,13 et les formats de sélection ^13,14,2 ont également été utilisés avec succès. Considérations critiques pour la configuration et la conduite des sélections avec contrôle parallèle de paramètres de sélection visant à identifier et isoler anticorps monoclonaux spécifiquement enrichis pour la validation sont détaillées.