在啮齿动物中枢神经系统的体内光遗传学刺激

！注意：此协议涉及使用3B类激光器，并需要适当的培训和安全准则得到遵守。护目镜必须在任何时候运行激光器的时候穿，用对齐程序提出特别高的风险。接触激光提供商以确定眼镜，将对于给定的激光提供最大的衰减。如果有的话，报名参加的机构的激光安全培训课程。切勿操作激光没有适当的安全眼镜和培训。 1.激光装置的建立在适当情况下，在第1步骤被指定为（A）或（B）中，以单或双激光系统之间，分别区分。 安装并固定激光器的线路板。实验板是优良的热导体与作为散热器，以防止损坏内部激光元件长时间使用。 （A）固定预连接拉斯呃到10“×12”面包板（或必须）使用¼-20“帽螺丝和垫圈（ 图2A）。如果面包板孔不与激光安装孔对齐，用小'表夹“，以确保激光面包板上。 （b）如果要使用的2激光器具有非常不同的光束的高度（>约1厘米），用小4“×6”面包板创建平台激光器之一。这些附加电路板的主要大12“×18”采用¼-20“帽螺丝垫圈线路板，那么激光连接到使用盖螺丝或夹子表的小板， 如图2B。直接连接其他激光用螺丝帽或可变高度表夹在面包板上。 关键的一步：面包板，螺钉和光学元件可以购买英制或公制所以在购买物品的时候是一致的;默认此协议是帝王。 （A）附加一个厚夹套平面裂开/物理接触（FC / PC）跳线到耦合器（称为成色帘线; 见图3），其物理地附接到激光（ 图2A）的前面。 （B）的螺纹联接到3/4“光后，再环氧耦合器和使用JB佳柏，或类似的环氧柱的顶端之间的连接，以防止在使用过程中松动和错位。连接后的线路板（如线路板孔不会总是排队与光学元件，柱座，底座适配器所需的位置，并且夹紧叉是用来固定连接器的光学职位地方）。附加一个厚夹套接插线（耦合线）到耦合器的背面。 （B） 插入第一个转向镜的蓝色激光进运动持有者，它使用的是¾“光学后连接到线路板。这个帖子附加到一个ADAP基地器和夹紧叉。定位夹紧叉并直接在蓝色激光的前支柱组件与反射镜成45°引导朝向分色镜的激光。用孔的格子图案的线路板作为一个粗略的定位导向。一旦粗略定位，用1/4“-20螺栓固定夹紧叉线路板（ 见图2B，C）。 （B） 将分色镜成运动支架并将其连接到一个1“光后，直接固定到线路板。分色镜定位到最左侧的，和在同，蓝色激光镜像线。角的分色镜以45度角，使得蓝色光反射离开第一反射镜被反射到耦合器，然后拧紧螺钉的运动保持器附接至后（参见图2B，C）。 （B）将第一转向镜黄色激光3/4“光学职。附加OPTICAL后到基本适配器和夹紧叉。定位夹紧叉，并直接在黄色激光和角镜的前面的后合奏以45°角，使得黄色光将朝向第二转向反射镜被导向。固定夹紧叉的地方与1/4“-20带帽螺丝和垫圈。 （B）将第二转向镜黄色激光1“光学职。角反射镜，使得黄色光束从第一反射镜将通过分色并进入耦合器（ 图2C）被反射。直接固定岗位的线路板，拧紧固定螺丝，一旦镜角度的恰如其分。细镜调整将使用可调镜座在后面的步骤制备。 （B）将中性密度滤镜轮到¾“光后和后放入连接到安装底座柱座。确保合奏的第一和本身之间的线路板COND黄色反光镜使用的是单一的¼“-20螺栓。这轮是用来调整的黄色激光到达耦合器中的功率。 提示：它们连接到基座前，单独收紧所有组件（如持有可调镜持有人的职位顶部的螺丝，并保持基本适配器的帖子底部的线程）。用小六角扳手的轴在所提供的通孔中的光职位以获得足够的扭矩。这将防止部件松动在使用过程中，因此需要调整。 附加的FC / PC到FC / PC L型支架适配器的线路板。 可选：直接固定1×2 50/50迷你立方体光纤分路器的线路板可同时在体内刺激两个或两个以上的动物。此外，手柄可被添加到辅助电路试验板组件的运动（如在图2A中看到的那样）。 2.激光耦合（非接触式联轴器） 本节中涉及到双激光设置（ 图2B）。调整外黄激光路径之前对准内部的蓝色激光的路径。 ！注意：使用低光功率耦合（〜1毫瓦），以保证眼睛的安全。穿在激光和直到光强度被测量并且被认为是安全的防护眼镜到电源。 上设置激光的背面的开关，以“电流”（电流）和晶体管 – 晶体管逻辑模式（TTL）+为恒定的照明（相对于模拟模式）。确保在驾驶员的前方的电源按钮被设定为零。通过接通该驱动程序，然后再在激光键开启激光器。 缓慢调节位于所述激光驱动器，使得〜1毫瓦的激光光被发射的前面的电源按钮。等待10 – 15分钟（或制造商指定的）激光预热。 直接连接光缆测试仪的FRE耦合器尾纤电子端打开电缆测试仪（ 图3A）。调节耦合器的角度，使红色光束行进直背朝向分色镜的中心。红光从电缆测试器发射的光的光束路径是输入激光光将需要以跟随要被连接到激光器的准确路径。 执行粗对准：使用横向和水平旋钮上的运动反射镜引导激光的光束进入耦合器。基座夹具可能需要被松开以略微重新定位反射镜和耦合器。运动坐骑应该还是有可用于进一步微调一些旅游。不要担心，如果没有蓝光在这个时候被排放出来的耦合器，连接跳线。 放置一个单件半透明纸直接在二向色镜的前方，在二向色和耦合器之间。会有两个蓝色和ar编点对本文从激光和电缆测试仪，分别。使用的纸张是半透明足以同时从纸张的同一侧同时看到红色和蓝色斑点。 进行微调，以第一转向反射镜（ 即，一个接近激光，而不是分色）通过仔细调节的横向和水平旋钮对准红点与蓝点的中心。 移动纸张背面朝向耦合器，以便它是直接在耦合器的前面，并调整旋钮上的第二 （ 即，二向色）镜对准激光光束的红色光束。 迭代步骤2.6＆2.7直至蓝色/黄色和红色光束的中心在两个位置被精确地对准（ 即，直到红色和蓝色光束是共线的）。 卸下电缆测试仪从耦合线。激光光线现在应该从耦合器接插线的末端射出。 Determi通过测量光功率从使用功率计成色接插线的光纤尖端发射ね耦合效率。使用在功率计上的光电二极管500毫瓦的设置和改变的波长设定（λ）为蓝色（473纳米）或取决于激光黄色（635 nm）的光谱的光被使用。 放置光纤尖端沿垂直于光电二极管，以获得功率读数。比较光功率输入耦合到光功率从光纤末端射出。 > 80％的耦合效率被认为是非常不错的。第二转向镜非常小的进一步调整，有时略有改善耦合。在一般情况下，当从耦合光纤的末端的波束图案是一个小的，紧，中央点（无环周围），耦合效率进入纤维芯是最佳的。 重复步骤2.1 – 2.11黄激光耦合，除了使用两个导引反射镜为黄色激光（参见图2C）。没有做吨调整分色镜或蓝色激光的取向的位置将被丢失。 3. 在体内光遗传学刺激确保涉及动物使用的任何程序都符合当地和国家的方针由相应的机构动物护理和使用委员会进行批准。 光纤设置（ 见图3B用于识别不同类型的接插线的下文）。激发一个单一的鼠标，使用直接连接到线路板的FC / FC L型托架适配器耦合接插线连接到一个厚夹套接插线（参见图4A）。刺激两种动物从一个激光器，使用1×2 50/50的微型立方体成色接插线连接两个厚夹套接插线（参见图4B）。为了刺激三个或更多的动物，附加连接器电源线使用1×2米的多模光纤分路器INI立方体已经连接到线路板（ 见图4C）。 附加一个换向器/旋转接头的厚夹套接插线/纤维分离器的自由端。换向器是必不可少的，因为它们允许与啮齿动物的运动，从而防止转矩的积累在接插线的光纤的旋转。过多的扭矩可以捻帘线，导致断裂，而在测试期间与动物的自然运动干涉。 附加动物跳线到换向器。 附加的连接分离套筒动物跳线（ 图5）的自由金属套圈结束。不要强行套一路攀升套圈;离开〜0.5厘米套筒的外露因为这是连接到植入的光纤固定到动物（ 图6）。 关键的步骤：请购买包含分裂，使连接在胀紧套在植入光纤插芯的袖子，去除。过紧一个合适的能引起严重的创伤给动物如果从头骨试图断开从植入物的套筒，当植入物被驱逐出来。如果这确实发生，动物应该从研究中删除，并立即得到兽医照顾。同样地，利用第一次的新套筒之前，通过插拔的套圈，直到它与力的所需量的断开“打破它在'。 提示：这是很容易折断的纤维，同时除去被紧紧附连到箍圈的套筒。为了避免这种情况， 推动套圈通过插入一个小木棒插入套管（标准棉签的手柄大小合适）的开口端。 蓝色激光驱动器连接到使用BNC电缆脉冲发生器和打开脉冲发生器。 穿戴合适的护目镜。上设置激光到“电流”和“TTL +”模式的背面的开关。确保塔吨对驾驶员的前面的电源按钮被设定在零andturn上的激光（打开第一驱动程序，然后该激光键）。 调整激光的前面的电源按钮，使5 – 10毫瓦正在从动物跳线光纤尖端作为使用光功率计测量发射的光。 5 – 10毫瓦是一般准则-影响组织的一个给定的体积，应先于实验开始计算，如在Aravanis 等所需的具体功率强度3。 切换蓝色激光来“模拟”模式在体内的刺激。注：黄色DPSS激光器在TTL +模式恒定的照度操作。等待10-15分钟的激光预热。 轻轻抑制鼠标和连接分割套筒形式的动物用接插线的慢性植入纤维（参见图6）。确保两个光纤的端部使身体彼此接触。使用分割上的连接套筒作为窗口的可视化，两者之间的直接接触关键的一步：有时碎片可以收集关于动物的植入纤维的金属制套圈，干扰的正确连接。在这种情况下，使用乙醇擦拭，轻轻地清洁的动物的头套圈之前附件。切勿强行将连接套筒在套圈，因为这可能会导致严重创伤的动物。如果纤维端部之间的物理连接不能在清洗后进行，从研究中除去的动物。 提示：光泄漏可以发生在植入纤维和动物跳线之间的连接点。这种光的老鼠可视化可能会出现一个实验变乱10。热缩管可连接到接插线和滑过的连接点，以减少外来光。 让鼠标恢复为以前的行为测试开始几分钟。 提示：Depending在行为测试到给药，最好是2，观察者只小鼠到连接和束缚方法 – 先有3天，根据需要的处理以连接该动物可能诱发应力，颠倒行为测试。 将鼠标在行为测试设备，确保连接线是免费的碰壁的。从来没有刺激时留下的动物无人值守。即使使用换向器，跳线确实有一种倾向，在延长的时间段，以扭曲和与行为测试可能会干扰。 使用脉冲发生器脉冲蓝色激光以预定的频率，这将激活选择的视蛋白。用于黄色激光用途：脉冲黄色激光与外部百叶窗或通过简单地阻挡的光束路径用不透明的，非反射性的，不易燃的对象。 4.后在体内刺激的注意事项此部分不打算成为一个完整的原山坳但提供作为该应下在体内光遗传学刺激被认为是额外的程序指导。 在实验完成后，确认病毒和纤维铺放组织学的行为结果准确解释。根据机构指南安乐死的动物和灌注用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和4％（重量/体积）低聚甲醛在PBS中的动物。 牢牢抓住外露的金属套圈用钳子止血或删除植入的光纤。在一个平稳，但迅速，运动拉起。它通过测量光输出在每个实验结束时，测试植入纤维的完整性是重要的。 通过感兴趣区域切片之前48小时 – 在多聚甲醛后固定的大脑至少24。 （如果使用冷冻切片，切片之前孵育大脑中有30％的蔗糖溶液对数天）。使用standa进行免疫组化次协议用 ​​于检测适当视蛋白标记的荧光团， 即，绿色荧光蛋白（GFP），增强的黄色荧光蛋白（EYFP）或mCherry。 查现场视蛋白的表达和纤维植入物的显微镜下目视确认病毒注射和植入物的基础上选择的坐标的合适的位置。