High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em> E. coli</em

Deel A: Transformatie en Test Expression Handmatige procedures voor klonering 22 en transformatie gezuiverd worden elders 24 besproken. De transformatie protocol kan volledig worden uitgevoerd op de robot 26, maar het is meestal tijdsefficiënte handmatig te doen. Daarom is de protocollen hierin beginnen vanaf de enting van de expressie precultures en plating van de transformatie van het vuur geschokt transformatie mengt handmatig gedaan. Voor meer informatie over de handmatige klonen en transformatie procedures zie de relevante verwijzingen 22,24. 1. Precultures en Plating Bereid de robot werktafel (zie figuur 4 voor functies): Zet een 300 ml buis met 150 ml steriel LB-medium (aangevuld met ampicilline (100 ug / ml) / chlooramfenicol (34 ug / ml), of andere geschikte antibiotica) op positie 8. Zet een steriele DW96 op positie 11. Put 4x voorbereide 24-well LB agar (Amp / Cam) weefselkweek platen (met 2 ml agar in elk putje) met hun deksels op in de posities 14 tot 17. Plaats de transformatie plaat (met de 96 transformatie mengt na hitteschok) op positie 13. Dit wordt gebruikt om de vloeistof precultures en LB agarplaten inoculeren. Zet een doos van steriele 200 ul pipet tips op positie 18. De 96-meerkanaals arm (MCA96) en 200 gl tips, aspireren 200 pi LB-bouillon (positie 8), en afzien in de DW96 op positie 11. Herhaal tot er een eindvolume van 1 ml LB-medium in elk putje van de DW96. Dit zal de vloeistof voorkweek worden. Met behulp van de robot manipulator (Roma), verwijder het deksel van de eerste 24-well LB agar plaat en zet deze elders (bijvoorbeeld in een hotel drager) totdat de beplating is voltooid voor die plaat. Met behulp van de 8-kanaals vloeistof handling (liha) hoofd, meng vervolgens aspireren 50 pl thij eerste kolom van de transformatie mengsel op positie 13. Dit volume transformatie mengsel net genoeg om de LB-Agar goed bedekken. Met de eerste 4 kanalen afgeven op de eerste kolom van de eerste 24 putjes LB agar plaat op positie 14 (zie figuur 5). Met de laatste 4 kanalen, afzien op de tweede kolom van de eerste 24-well LB agar plaat. Was alle tips grondig na doseren. Herhaal dit proces totdat alle transformaties zijn bedekt op de eerste plaat op positie 14, de overdracht van 96 – tot 24-wells met behulp van de bedrijfstoeslagregeling waarin is voorzien in figuur 5. Zodra de eerste plaat is voltooid, gebruikt u de Roma naar het deksel vervangen en verwijder het deksel van de volgende plaat op positie 15. Beweeg met de beplating regeling voor de komende 3 platen. Zodra plating gedaan is, stelt de Te-Shake tot 1.200 tpm en schud alle platen gedurende 1 minuut tot een homogene verdeling van de transformatie mix hebben. </li> Met behulp van de MCA96 en de originele pipet tips, meng dan aspireren 60 ul van de resterende transformatie mix (positie 13) en afzien in de DW96 met LB-bouillon op positie 11. Dicht de DW96 precultures met ademende zelfklevende folie aan cultuur beluchting mogelijk te maken. Plaats in een 37 ° C incubator schudden op maximale snelheid O / N (200/800 rpm afhankelijk van shaker orbitaal). De LB-agar-platen moeten in een kap met hun deksels worden geplaatst af te drogen (10 min). Daarna worden ze omgekeerd geplaatst in een 37 ° C incubator plaat tot de volgende ochtend. De volgende dag wordt de voorkweek gebruikt om de test expressie in auto-inductie medium en voor de bereiding van glycerol voorraden inoculeren. Zet de agarplaten in een koelkast, een back-up. Indien nodig, vanaf de agar platen of de glycerol voorraden, de test uitdrukking zou opnieuw kunnen worden gedaan door het enten van een frisse LB precultuur direct. 2. Voorbereiding van de DW24 Zyp-5052 Plates OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 5 minuten in te vullen voor elke set van 4x DW24 platen. Vul 500 ml Zyp-5052 auto-inductie medium voor elk exemplaar van 96 kweken (464 ml ZY medium, 250 gl 2 M MgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, in die volgorde – recepten voor elke component in tabel 1) aangevuld met de juiste antibiotica. Bereid de robot werktafel: Plaats twee 300 ml troggen, elk ~ 250 ml medium op positie 5 en 6. Zet vier steriele DW24 platen op posities 14 tot 17. Put 200 pl gesorteerd op positie 18. Met behulp van de MCA96 en 200 ul tips, aspireren 200 ul van Zyp-5052 van positie 5 en afzien in de eerste DW24 plaat op positie 14. Doe dit in totaal 5 keer (4 tips zal afzien in een enkele, goed in een keer voor een totaal 4 ml). Herhaal dit voor de resterende 3 x DW24 platen op de posities 15 tot 17, schaching aan de Zyp-5052 op positie 6 voor de laatste twee DW24 platen. 3. Inenting en de groei van de Test Expression Cultures OPMERKING: Inenting duurt ongeveer 10 minuten in te vullen voor elke set van 4x DW24 platen, en de groei gaat door O / N. Bereid de robot werktafel: Leg de DW96 plaat met de precultures (uit stap 1.15) op positie 11. Leg de vier DW24 platen die Zyp-5052 medium (uit stap 2.3) op de posities 14 tot 17. De liha verzamelbak 100 pl voorkweek van positie 11 naar test expressie kweken (1/40 verdunning) inoculeren met de regeling in figuur 5. Was de liha kop grondig in het wasstation tussen elke kolom van de 96-well precultures. Verzegel de DW24 platen met ademende film en incubeer bij 37 ° C onder schudden (200/400 rpm) gedurende 4 uur. Dit is de tijd van de groeifase waarin glucose van het medium bij voorkeur zal worden uitgeput 27. Verlaag de temperatuur tot 17 ° C. Na de 4 uur en uitputting van glucose, lactose zal beginnen te worden gemetaboliseerd, wat leidt tot inductie van meningsuiting, het verstrekken van de optimale groeiomstandigheden voor BL21 (DE3) pLysS of Rosetta 2 (DE3) pLysS, in dit werk 22. Laat de cellen om O / N. uiten Gebruik de resterende precultuur om glycerol voorraden maken. 4. Bereiding van glycerolvoorraden OPMERKING: glycerol voorraden worden in drievoud worden opgeslagen op verschillende locaties bij diepvriezer storing. Bereid de robot werktafel: Zet microtiterplaten op positie 5 tot 7 de glycerolvoorraden huisvesten. Zet een 300 ml bak gevuld met 50 ml 100% glycerol op positie 8. Leg een DW96 met 800 pl precultuur (na stap 3.2) in elk putje op positie 11. Put 200 pl gesorteerd op positie 18. Met een slow aspiratie en doseren snelheid, gebruik maken van de MCA96 en 200 ul tips om glycerol toe te voegen in de DW96 met de precultures. Verzamelbak 200 pi glycerol (van positie 8). Pipetteer 150 ul (op positie 11), daarna pauzeer 20 seconden om de resterende glycerol onderaan de punt bereiken. Breng de resterende 50 pl. Met dezelfde tips, meng de cultuur en glycerol in de DW96 op positie 11 tot ze goed gemengd zijn. De uiteindelijke concentratie van glycerol is 20%. Aspireren 140 ul van de DW96 en afzien in de eerste microtiterplaat op positie 5. Herhaal stap 4.3 voor elke resterende microtiterplaat (posities 6 en 7). Seal elke microtiterplaat met plastic plakband en bewaar bij -80 ° C. Gooi de resterende cultuur in de DW96, ontsmetten met een antimicrobieel middel voor verwijdering. 5. Beoordelen van de groei van de culturen <p cdeerntje = "jove_content"> Opmerking: Het is meestal noodzakelijk om de uiteindelijke groei beoordeelt de uiteindelijke OD 600 is meestal hetzelfde voor de meeste culturen (ongeveer 12 onder deze omstandigheden) echter elke cultuur die niet worden opgemerkt. Neem 50 pi van elke cultuur (uit stap 3.4) en afzien in een platte bodem, duidelijk microtiterplaat met 150 pl medium. Meet de OD 600, rekening houdend met de 4-voudige verdunning. Als die er zijn die niet erg goed gingen groeien, noteer deze voor de uiteindelijke analyse. 6. Oogsten van de cellen OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 45 minuten in beslag. Centrifugeer de 4x DW24 platen (uit stap 3.4) bij 3000 xg gedurende 10 min dan de bovenstaande vloeistof in een afvalcontainer met een antimicrobieel middel. Tik op de platen, upside-down, op absorberend papier om overtollig medium te verwijderen. In de tussentijd bereiding van 100 ml lysisbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8, of andere gewenste buffer) bevattende lysozym (eindconcentratie 0,25 mg / ml). Bereid de robot werktafel: Zet de lysis buffer in een 300 ml trog op positie 5. Leg een schone DW96 op positie 11. Leg de 4 x DW24-platen die de cel pellets (uit stap 6.1) op de posities 14-17. Zet 200 ul tips op positie 18. Met behulp van de MCA96 en 200 ul tips, aspireren 125 ul van lysis buffer van positie 5 en afzien in elk DW24 plaat (posities 14-17). Herhalen. OPMERKING: 4 tips zal afzien in een enkele, goed in een keer voor een uiteindelijk volume van 1 ml in elk putje van de DW24 platen. Schud de platen op posities 14-17 met de Te-Shake (1000 rpm) gedurende 15 minuten om de pellets mengen. Nadat de pellets worden geresuspendeerd, gebruiken de eerste 4 kanalen van de liha 550 pl zuigen uit monsters 1 tot 4 (de eerste kolom van de eerste DW24, op positie 14), vervolgens de last 4 kanalen van de liha verzamelbak 550 ul monsters 5 tot 8 (de tweede kolom van de eerste DW24). Afzien in de eerste rij van de DW96 op positie 11. Herhaal stap 6.6, zodat alle celsuspensie wordt overgebracht naar de DW96. Na elke reeks monsters was de liha tips in de was station. Herhaal stap 6,6-6,8 voor elke kolom in elk DW24 plaat (posities 15-17) met de regeling in figuur 5. Verbinding met plastic folie. Voor zuivering op dezelfde dag of op korte termijn invriezen, bewaar bij -80 ° C gedurende ten minste 1 uur, of anders bij -20 ° C. Deel B: Zuivering en analyse 7. Cell Lysis OPMERKING: Deze procedure duurt ongeveer 60 minuten in beslag. Ontdooi de bevroren celsuspensies (uit stap 6.10) in een waterbad (bij kamertemperatuur of 37 ° C) gedurende ongeveer 15 minuten en resuspendeer in de schudincubator voor eenANVULLENDE 10 minuten. De culturen moeten stroperig. Neem 500 ul van DNase voorraad en meng het met 1 ml MgSO4 voorraad. Handmatig met een 8-kanaals pipet of de robot liha, afzien 15 pl in elk putje van de DW96, tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml DNase en 20 mM MgSO4 geven. Re-verzegeling van de plaat met plastic tape en schud nog eens 15 minuten. Op dit punt de kweken niet-viskeus moet zijn. Controleer zorgvuldig (visueel onderzoek) dat alle culturen zijn niet meer viskeuze. Opmerking: Dit is essentieel, als sommige culturen nog viskeus (bijvoorbeeld als het DNase per ongeluk vergeten of verkeerd afgeleverd in sommige putjes), de filter verstoppen, genereren van een ongelijke druk op de monsters en overloop of volledige verstopping van de filter plaat zou kunnen gebeuren tijdens de zuivering. Voor SDS-PAGE monsters van het gehele cellysaat, aspireren 10 ul lysaat en afzien in een 96-well plaat met PCR10 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer en 20 pl water. Denatureren gedurende 3 min bij 95 ° C en vries tot analyse (Totaal fractie). Als een HTP elektroforese systeem beschikbaar is, kunnen de monsters worden geanalyseerd op deze plaats naar aanleiding van de fabrikant aanbevolen protocol voor de monstervoorbereiding. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10. 8. Ni Affinity Purification OPMERKING: Een langzame aspiratie snelheid moet worden gebruikt voor pipetteren alle hars schorsingen, zoals de schorsingen zijn vrij dik. Over het drogen van de hars leidt tot een vermindering bindingscapaciteit. Voor zuivering de gespecificeerde imidazool concentraties voor nikkel affiniteitshars. Als alternatief ionen (bijvoorbeeld kobalt) worden gebruikt, dan moeten de concentraties worden aangepast. A – Ni affiniteitszuivering voor detectie in het bereik van 1-100 mg / L (uiteindelijke hars volume = 200 ul) OPMERKING: Tzijn reiniging duurt ongeveer 1,5 uur in beslag, waardoor tot 4 in een dag kunnen worden uitgevoerd. Bereid de robot werktafel: Put 300 ml troggen met bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8), wasbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazool, pH 8) en elutiebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8) op de posities 6 tot 8, respectievelijk. Laat een lege 300 ml trog op positie 5 voor de harsslurry. Op positie 9 en 10 put plaat houders. Op positie 10 zet een DW96 met de SPE blok en filter / ontvanger plaat (20 micrometer) op de top. Plaats de DW96 met het lysaat (van stap 7.3) op positie 14. Op positie 18 en 19 zet de 200 ul wijde boring uiteinden en 200 ul uiteinden respectievelijk. Zet twee extra DW96 platen voor het wassen en elutie in een hotel. OPMERKING: Ze kunnen ook op een andere locatie worden gelegd op de werktafel of in een hotel niet beschikbaar is. Bereid 105ml in evenwicht 33% harsslurrie (35 ml hars + 70 ml bindingsbuffer). Voeg de harssuspensie aan de trog op positie 5 onmiddellijk voor het begin van de procedure. Met behulp van de MCA96 en 200 ul wijde boring tips (positie 18), meng de harsslurry op positie 5 grondig voor het aanzuigen en afgeven van 200 ul van harsslurrie in de DW96 met het lysaat op positie 14. Herhaal dit twee keer zodat 600 ul van harsslurrie werd toegevoegd aan het lysaat, het mengen van de hars suspensie voor elke aspiratie. Voer een 10 min mengstap met de MCA96 op positie 14 te kunnen binden en te voorkomen dat de hars pelleteren. Aspireren van positie 14 en verdeel 800 pl (in 200 pl percelen) op de filterplaat op positie 9, mengen vóór elke aspiratie anders het hars wordt onderaan de DW96 behouden. Zet het vacuüm op positie 10 gedurende ongeveer 90 seconden aan het lysaat door de plaat weer in deDW96 aan het verzamelen van de doorstroming, de zorg niet om uitdrogen van de hars. Zet de stofzuiger uit. Herhaal stap 8.1.5 en 8.1.6, zodat alle hars dan de filterplaat. Met behulp van de Roma-arm te bewegen de SPE blok die de filter plaat van positie 10 naar positie 9, zodat de volgende wasbeurt stap gaat rechtstreeks naar het afval en de overdracht van de DW96 met de flow-through op positie 10 naar een andere site (bijvoorbeeld in een hotel drager) tot het einde van de procedure. Met een nieuwe reeks van 200 pl voor (op positie 19), was de hars (op positie 9) met een totaal van 800 pi bindingsbuffer (van positie 6), en vacuüm toe te passen op positie 9, totdat de buffer doorlopen . Herhaal dit nog een keer. Gebruik de RoMa arm om een ​​nieuwe DW96 plaatsen op positie 10 van de 50 mM imidazol wassen verzamelen en verplaatsen van de SPE blok en filter plaat terug aan de top (positie 10). Voeg 800 ul van wasbuffer van positie 7 op positie 10, draai devacuüm op totdat de buffer gepasseerd is. Schakel de stofzuiger uit. Met de ROMA, verwijder de SPE blok en filter plaat in positie 9 en de DW96 met het wassen monster naar het hotel, en houd het opzij tot het einde van de procedure. Was de hars met nog eens 800 pi wasbuffer (van positie 7 op positie 9), van toepassing het vacuüm totdat de buffer gepasseerd is. Herhaal dit nog een keer. Gebruik de Roma naar een nieuwe DW96 plaatsen op positie 10 en plaats de SPE blok en filter plaat terug aan de top met de retentietijd te verzamelen. Voeg een totaal van 500 ui elutiebuffer (van positie 8 op positie 9) en incubeer in situ gedurende 3 minuten. Zet de stofzuiger totdat alle buffer gepasseerd is. Optioneel: Voor zeer uiten van eiwitten, een tweede elutie kan worden uitgevoerd in een frisse DW96 zoals in stappen 8.1.14 en 8.1.15. Monsters nemen van de doorstroom, wassen en elutie / s voor SDS-PAGE of HTP elektroforese. <li> Voor SDS-PAGE monsters van de doorstroom, afzien 10 pi in een 96-wells PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer en 20 pl water. Voor SDS-PAGE monsters van de was-en elutie / s afzien 30 pi in PCR-platen met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer. Denatureren gedurende 3 min bij 95 ° C en vries tot analyse. Voor HTP elektroforese monsters, volg dan de instructies van de fabrikant. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10. B – Ni affiniteitszuivering voor detectie in het traject van 0,1-25 mg / L (uiteindelijke hars volume = 50 ul) Opmerking: Deze zuiveringsprocedure duurt ongeveer 30 minuten in beslag, waardoor tot 12 in een dag kunnen worden uitgevoerd. Bereid de robot werktafel: Put 300 ml troggen met bindingsbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8), wasbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol pH 8)en elutiebuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazool, pH 8) op de posities 6 tot 8, respectievelijk. Laat een lege 300 ml trog op positie 5 voor de harsslurry. Op positie 9 en 10 put plaat houders. Op positie 10 zet een DW96 met de SPE blok en filter / ontvanger plaat (20 micrometer) op de top. Zet de DW96 met het lysaat (uit stap 7.3) op positie 14. Op positie 18 en 19 zet 200 ul wijde boring tips en 200 ul tips, respectievelijk. Zet een extra 96-wells microtiterplaat voor de elutie in een hotel. OPMERKING: Dit kan ook op een andere locatie die op de werktafel of in een hotel niet beschikbaar is. Bereid 50 ml in evenwicht 25% harsslurrie (12,5 ml hars + 37,5 ml bindingsbuffer). Voeg de harssuspensie aan de trog op positie 5 onmiddellijk voor het begin van de procedure. Met behulp van de MCA96 en 200 ul wijde boring tips (positie 18), meng de harsslurry op positie 5 grondig voor opzuigen en Vervennsing 200 pl hars slurrie in de DW96 met het lysaat op positie 14. Incubeer bij kamertemperatuur onder schudden met behulp van de Te-Shake bij 1400 rpm gedurende 10 min om binding mogelijk te maken. Aspireren van positie 14 en afzien van de volledige 1200 pl (in 200 pl percelen) met de wijde boring voor (positie 18) op de filterplaat op positie 10. Meng voor elke aspiratie anders het hars wordt onderaan de DW96 behouden. Schakel het vacuüm op op positie 10 voor ongeveer 30 seconden om het lysaat filteren door middel van de plaat in de DW96 aan het verzamelen van de doorstroming, de zorg niet om uitdrogen van de hars. Zet de stofzuiger uit. Met behulp van de Roma-arm, verplaats de SPE blok die de filter plaat van positie 10 naar positie 9, zodat de volgende wasbeurt stap gaat rechtstreeks naar het afval en de overdracht van de DW96 met de flow-through op positie 10 naar een andere site (bijvoorbeeld in een hotel drager) tot het einde van de procedure. Met de 200 μl voor (op positie 19), was de hars (op positie 9) met een totaal van 800 pi bindingsbuffer (van positie 6), en vacuüm toe te passen op positie 9 totdat de buffer gepasseerd is. Herhalen. Gebruik de RoMa arm om de verse DW96 plaatsen op positie 10 van de 50 mM imidazol wassen verzamelen en verplaatsen van de SPE blok en filter plaat terug aan de top (positie 10). Voeg 150 ul van wasbuffer van positie 7 op positie 10, zet het vacuüm op totdat de buffer gepasseerd is. Schakel de stofzuiger uit. Met de ROMA verwijder de SPE blok en filter plaat in positie 9 en de DW96 met het wassen monster naar het hotel, en houd het opzij tot het einde van de procedure. Was de hars met nog eens 800 pi wasbuffer (van positie 7 op positie 9), van toepassing het vacuüm totdat de buffer gepasseerd is. Herhalen. Gebruik de Roma naar de microplaat plaatsen op positie 9 en plaats de SPE blok en filter plaat terug aan de top te e verzamelene elutie. Voeg 190 pl elutiebuffer (van positie 8 op positie 9) en incubeer in situ gedurende 3 minuten. Breng het vacuüm totdat alle buffer gepasseerd is. Monsters nemen van de doorstroom, wassen en elutie voor SDS-PAGE of HTP elektroforese. Voor SDS-PAGE monsters van de doorstroom, afzien 10 pi in een 96-wells PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE monsterbuffer en 20 pl water. Voor SDS-PAGE monsters van de was-en elutie / s afzien 30 pi in PCR-platen met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer. Denatureren gedurende 3 min bij 95 ° C en vries tot analyse. Voor HTP elektroforese monsters, volg dan de instructies van de fabrikant. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10. 9. Tag Splitsing (optioneel) Voeg de TEV protease (2 mg / ml) aan het geëlueerde eiwit (van stap 8.1.15 (en 8.1,16) of stap 8.2.14) in een verhouding van 1/10 (v / v). Incubeer bij kamertemperatuur (of 4 ° C voor de temperatuur-gevoelige eiwitten) O / N onder zacht schudden. Aan het einde van splitsing afzien 30 pi in een PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer of volg de instructies van de fabrikant voor de HTP elektroforese monsters. Filter de resterende splitsing mengsel (van stap 9.2) via een 96-well filterplaat 0,22 urn en verzamel de oplosbare doorstroming in een DW96 door toepassing van vacuüm. Dit kan op een van de vacuüm locaties (bijvoorbeeld positie 10) op de vloeistofverwerking robot, zoals voor de elutie in paragrafen 8.1 en 8.2. Dit verwijdert alle eiwit dat neergeslagen tijdens decollete. Na filtratie afzien 30 pi in een PCR-plaat met 10 ul van 4x SDS-PAGE sample buffer of bereiden zoals HTP elektroforese monsters. Dit maakt de vergelijking van het eiwit voor splitsing, het mengsel na splitsing en soluble eiwit dat overblijft na splitsing en geeft goede aanwijzingen van de verwachte resultaten in de daaropvolgende schaal-up experimenten. Voor meer details over de analyse van de monsters zie paragraaf 10. 10. Analyse van de resultaten Identificeer de constructen tot expressie oplosbare eiwit door analyse van de zuivering monsters aan SDS-PAGE, dot blot of HTP elektroforesesysteem zoals Caliper LabChip. Analyseer de monsters elutie eerste constructen produceren van oplosbare proteïne te identificeren. In de meeste gevallen alleen de elutie monsters worden geanalyseerd als oplosbare constructen worden geïdentificeerd aan de tijd besteed aan de analyse te beperken. Als het eiwit niet in de elutie, lopen het wassen en doorstroming monsters te zien of het werd uitgedrukt en niet goed binden aan de hars. Voor constructen waarin geen oplosbaar eiwit kan worden gedetecteerd run het totaal cellysaat of de eiwit expressie. Opmerking: Een beperking is dat als de pprotein van belang niet boven de achtergrond expressie niveaus te presenteren, kan het niet mogelijk zijn om het eiwit te zien en kan leiden tot een vals negatief. Opgemerkt moet worden dat het altijd mogelijk is om eiwitten aan en neerslaan op de affiniteit hars en dit kan leiden tot een vals negatieve of onder-schatting van de opbrengst met de aanbevolen protocol (een zeldzame gebeurtenis in dit werk). Indien het eiwit precipiteert na elutie (witte pellet zichtbaar enkele minuten / uren na elutie) wordt aanbevolen de buffersamenstelling (bijv. zoutconcentratie) te veranderen en / of uitvoeren van een differentiële scanning fluorimetrie assay optimaliseren buffers. Een klein monster van de hars kan worden geresuspendeerd in SDS-PAGE monsterbuffer en gekookt om te detecteren of een eiwit wordt op de hars behouden. Als het eiwit niet werd uitgedrukt, maar de cellen heeft groeien, een nieuwe uitdrukking strategie voort te zetten, of als de OD 600 was niet hoog genoeg teruggroeien en opnieuw analyseren van de cultuur. </li> Bij splitsing monsters te analyseren, moeten ze worden geanalyseerd in een side-by-side wijze, zodat elke construct kan worden zichtbaar voordat een splitsing na splitsing in aangrenzende rijstroken, de analyse te vereenvoudigen. Tenzij volgens een methode die directe kwantificering van de elutie concentratie geeft, moet kwantificeren positieve monsters worden uitgevoerd door meting van de absorptie bij 280 nm (A280). Meet de A280, waarbij de extinctie coëfficiënt van het eiwit te houden en met de elutiebuffer als een spatie, een schatting van eiwitten op te leveren om de hoogste expressie oplosbare constructen identificeren. Voor de meest betrouwbare vergelijking van oplosbare opbrengsten, is het raadzaam om de opbrengsten te normaliseren door de dichtheid van de cultuur (met behulp van de OD 600 meting), die werd genomen in sectie 5. Als alle culturen groeide uit tot ongeveer dezelfde dichtheid, normalisatie is niet vereist. e "> 11. Kwaliteitscontrole Monsters kunnen direct worden geanalyseerd vanuit de elutie of splitsing monster door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC / MS). Alternatief ontzouten eerst (imidazool en eventuele buffer zouten die aanwezig zouden kunnen zijn) met ZipTip pipetpunten of vloeistofchromatografie methoden, vervolgens analyseren met behulp van matrix geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight (MALDI-TOF) en electrospray ionisatie ( ESI) massaspectrometrie. Kleine functionele studies kunnen worden uitgevoerd om te controleren of de functie van het eiwit is zoals verwacht. Als grotere hoeveelheden nodig zijn voor de functie, kan een opschaling cultuur worden gemaakt en de functie getest van de grotere cultuur eenmaal grootte en oxidatietoestand zijn bevestigd op de kleine schaal.