JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie und Infektion

ScanLag: High-throughput Kwantificering van Colony Groei en vertraging

Published: July 15, 2014
doi:
10.3791/51456
, ,
1Racah Institute of Physics,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Abstract

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Introduction

Bacteriën zijn geëvolueerd om te reageren op vele stressvolle omstandigheden. Een algemeen kenmerk van de aanpassing aan stress is een verandering in de groeidynamiek 1,2. Groeidynamiek worden meestal gekenmerkt door twee parameters: de exponentiële groei en de vertraging, namelijk de tijd die nodig is om aan te passen aan nieuwe omstandigheden. Overwegende dat een groot aantal high throughput methoden richten zich op metingen van de groei, de vertraging is vaak een vergeten parameter, maar het is de cruciale parameter voor de karakterisering van de aanpassing aan de nieuwe omstandigheden. Kwantificering van de aanpassing aan veranderende omstandigheden is traditioneel met bewerkelijke handmatige methoden 3,4. Meer recent zijn geavanceerde technieken ontwikkeld voor de analyse van enkele cellen 5,6. Het is echter nog steeds moeilijk om normale groei na een groeivertraging (dwz vertragingstijd) 2,3 trage groei onderscheiden. Een automatische methode werd gebouwd, ScanLag 7, teonderscheid tussen deze twee gelijkaardige fenotypen.

Een opvallend voorbeeld van het belang van de studie van de vertraging verdeling wordt onthuld onder behandeling met antibiotica. Veel antibiotica en andere belastingen doden alleen actief groeiende cellen, en derhalve cellen die "achtergebleven" beschermd 8. Voor het bewaken van vertraging, kan men enkele cellen waarnemen onder een microscoop en toezicht houden op de tijd tot de eerste divisie. Een belangrijk nadeel van deze werkwijze is dat de dynamische tijd is beperkt; die cellen die vroege groeien bedekken het oppervlak exponentieel, effectief verminderen van de groei van cellen met een langere vertragingstijd. Het gebruik van flow cellen enigszins omzeilt dit 5, maar een beperkt aantal cellen kunnen worden gevolgd en de fractie van bacteriën die de lag-fase verlaten nadat de meerderheid van de bevolking begonnen kweken kan niet worden waargenomen. Ondanks deze beperkingen hebben verschillende studies de invloed van het gehalte aan di geëvalueerdfferent wijst op vertraging verspreiden via enkele cel microscopie 9-12. Een andere manier om vertraging distributie controleren is door troebelheidsmetingen 13,14. Vele parallelle culturen, elk gestart vanuit een enkele cel, worden gekweekt in een optische densiteit lezer die het aantal bacteriën in de cultuur in de tijd meet. Deze methode is beperkt door de nauwkeurigheid van de extrapolatie en het aantal putjes in een plaat.

Een geautomatiseerde methode ontwikkeld, genaamd ScanLag, dat lag tijden en groei verdelingen in staat stelt om te beoordelen, zelfs voor het kleine percentage van bacteriën in een populatie die zeer lange vertraging tijden hebben. De methode is gebaseerd op detectie van kolonies op gebruikelijke voedingsmedia agarplaten 15 (figuur 1). Om detectie 16,17 automatiseren een reeks van commerciële scanners 18 die worden geleid door in het huis van software om regelmatig beelden van de platen te verwerven, werd ontworpen. Software wasontworpen om de beelden automatisch te analyseren en extraheren 19,20 kwantitatieve parameters, zoals de tijd van het verschijnen van elke kolonie groeitijd van elke kolonie, die hier wordt gedefinieerd als de tijd groeien van 20 pixels naar 80 pixels. Hier presenteren we de werkwijze details alsmede de opzet van het systeem en het gebruik van de geautomatiseerde beeldanalyse software die is verbeterd met een betere gebruikersinterface.

Deze methode kan worden aangepast aan andere kenmerken van kolonies, zoals morfologie en kleur te meten. Meting van deze typen parameters gebruik van het systeem multidimensionale phenomics mogelijk. Als de werkwijze kolonies van enkelvoudige cellen detecteert, kan het systeem nieuwe fenotypen die niet kan worden gemeten door populatie niveau metingen onthullen. De techniek maakt de detectie en ophalen van zeldzame varianten en vergemakkelijkt screenen op gewenste eigenschappen.

Protocol

1. Bouw de Setup Kies een flatbed scanner met een optische resolutie: 4800 dpi; Hardware resolutie: 4800 x 9600 dpi; kleurdiepte: 48 bit, dat kan werken bij de betreffende temperatuur en vochtigheidsgraad. Petrischaaltjes hebben aanzienlijk volume, in tegenstelling tot papieren meestal gebruikt voor commerciële scanners. De kolonies liggen bovenop de agar-laag, ongeveer 5 mm boven het oppervlak scanner. Opmerking: Voor de meeste scanners de kolonies worden scherpgesteld. Sommige bedrijven scanner niet aansluiten van meerdere exemplaren van scanner van hetzelfde type op dezelfde computer toe. Zorg ervoor dat er meer dan een scanner kan worden bevestigd en uniek geïdentificeerd. Bereid de accessoires, zoals hieronder beschreven: Bereid stukken van steriele zwarte vilten doek om de platen te bedekken (Figuur 1 stap 2). Om de petrischaaltjes zijn plaats te houden, bereiden witte plaat houders (Materialen en methoden) dat de scanners past en dat 6 hol hebbensen de grootte van de antennes (Figuur 1 stap 3). Indien nodig voor de groei van het micro-organisme, zet de scanners in een temperatuur gecontroleerde omgeving. Sluit de scanner aan op de computer. Optioneel: Sluit de relais aan op de computer en omzeilen de aan / uit schakelaar van de scanner om temperatuurgradiënt overwinnen. OPMERKING: Het relais unit is voor extreem temperatuurgevoelig micro-organismen. Deze schakelt de scanner, zodat de elektronica het oppervlak niet ongelijk niet verwarmen. Op een deel van de scanner oppervlak kunnen vergelijkbare resultaten. 2. Installeer de Scanning Manager Kopieer alle 'Scanning Manager' applicatie bestanden in een aangewezen map van http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html. Configureren ScanningManager.exe.config bestand volgens de scanners namen zoals ze in Computerbeheer-> Apparaatbeheer-> Imaging Devices ( <strong> Figuur 2). Voor het oplossen van problemen van de 'Scanning Manager' applicatie, zie de read me bestand. Voor meer documentatie over de 'Scanning Manager' applicatie, zie Documentation.html. 3. Voer een experiment Bereid de petrischalen (figuur 1): Verdun de kweek tot ongeveer 2000 CFU / ml. Plaat 0,1 ml van de cultuur gelijkmatig op de plaat oppervlak. Om een ​​goed contrast tussen de koloniën en het gerecht te krijgen en om vocht te absorberen, bedek de plaat met een stuk van steriele zwart vilt doek. Leg het deksel op de plaat. Plaats de platen in de houders op de scanners. Start het scannen Manager (Figuur 3): Kies de deelnemende scanners uit de lijst van gekoppelde scanners. Kies het aantal beelden die moeten worden genomen (Herhalingen), het tijdsinterval tussen opeenvolgende beelden (Time gap), en de vertraging voordat thij experimenteren (Start na). 4. Analyse van de Beelden OPMERKING: Een overzicht van computationele methoden is voorzien voor het analyseren van de beelden in MATLAB met "ScanLag", dat is gratis beschikbaar voor niet-commercieel gebruik op http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Verdere functies worden beschreven in de software handleiding, en een voorbeeld code wordt aangevuld. De beelden van elke scanner sorteren in aparte mappen. Met behulp van commando venster Matlab's, voert u de volgende procedures. De parameters die nodig zijn om deze procedures lopen zijn gedefinieerd in de software handleiding. Run PreparePictures naar voorbewerking uit te voeren: In preprocessing, worden de beelden van een scanner uitgelijnd. Elke petrischaal wordt bebouwd van elke sequentie van beelden. Het tijdstip waarop elk beeld werd verzameld wordt opgehaald uit de timestamp. Run TLAllPlates om detectie en tracering uitvoeren In each petrischaal afzonderlijk, kolonies worden opgespoord en krijgen een identificatienummer. Analyse van de geëxtraheerde gegevens: De afmetingen van elke gedetecteerde kolonie wordt gemeten als functie van de tijd. Om het uiterlijk verdeling van de koloniën te halen de volgende functies gebruiken in de command window Matlab's (nadere informatie vindt u in de software handleiding): Voer ScanLagApp de analyse van een bepaalde petrischaal samen weergegeven met de grafiek van de kolonies maat tegen de tijd (figuur 4). Gebruik de schuifregelaar om de huidige tijd van de plaat te veranderen. De timing zal ook worden aangegeven door een bijpassende verticale lijn op de koloniën gebied grafiek. Klik op een kolonie om de bijbehorende curve zien, en vice versa, klik op een bocht naar het bijbehorende kolonie vinden. Na het identificeren van de kolonie, kan het fenotype worden opgehaald door het plukken van de kolonie van de geïdentificeerde petrischaal. Defecten filter in de automatische analyse door Choozingen een kolonie en op de knop te sluiten. Bij het klikken exclusief het nummer van de kolonie wordt geel. Na het doornemen van de resultaten van de analyse van elke plaat, een samenvatting van de resultaten: Voer AddHistograms een histogram van verschijningstijdstippen creëren. Run plotDeathCurve een overlevingscurve vertegenwoordiging van de distributie te creëren. Ren GetAppearanceTimes om het uiterlijk tijd van alle kolonies te krijgen in het experiment.

Representative Results

Als voorbeeld van vertraging distributie extractie, Figuur 5 toont het vermogen van ScanLag elke kolonie identificeren en volgen specifieke kenmerken ene plaat over tijd, zoals zou gebeuren in een screeningstest. Bij de kweek van het micro-organisme heterogene, kan de verschillende subpopulaties openbaren zich tijdens de test. Bijvoorbeeld, Figuur 6 toont het uiterlijk kwantificering en dus onthult vertragingstijd bimodale verdeling een mutante stam van E. coli. De groei van de cellen beïnvloedt het uiterlijk tijdstip van de kolonie. Wanneer kolonies groeien met dezelfde snelheid, kan de late verschijning toe te schrijven aan de vertragingstijd (figuur 7). Te valideren dat de methode meet inderdaad de vertraging van enkele cellen, vergeleken we ScanLag resultaten met die verkregen met behulp van single-cell microscopie; deze validatie is aflopendribed in detail beschreven in een eerdere publicatie 7. Deze methode maakt controle van veel meer cellen dan worden geëvalueerd met microscopie. De verkregen microscopische verkregen middels ScanLag distributies grotendeels overlappen. De ScanLag distributie is iets breder; theoretische analyses voorspellen verbreding van de orde van de standaarddeviatie van de divisie tijd. Als de groei is verschillend voor elke stam, dient de oorsprong van de vertraging in uiterlijk nader onderzocht met behulp van andere methoden. De invloed van vroege lijkende kolonies op het verschijnen van kolonies later onderzocht. Controle-experimenten bevestigden 7 dat later uiterlijk niet zolang het totale aantal kolonies per plaat niet meer dan 200 (fig. 8) werd beïnvloed. Een ander controle-experiment bevestigde dat de plaats van de kolonie op de plaat niet beïnvloedde het uiterlijk 7. De analyse van de plates is gekalibreerd om specifieke drempels die wijziging nodig zou kunnen hebben, afhankelijk van voedingsstoffen in groeimedium of het type micro-organisme. Toch is de analyse vrij robuust voor een groot aantal drempels zoals getoond in figuur 9. Figuur 1. Een schematisch diagram van de stappen die nodig zijn om een kolonie uiterlijk verdeling maken. Figuur 2. Een screenshot van de Device Manager toont de namen van de aangesloten scanners, en van het configuratiebestand. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur. Figuur 3. Een screenshot van de Scanning Manager. Figuur 4. Een screenshot van de ScanLagApp. Een afbeelding van de plaat aan de linkerkant, en de groeicurven van elke kolonie zijn in het rechtervenster, zoals beschreven in de handleiding. De pieken in enkele kolonies gebied krommen optreden wanneer twee of meer kolonies samenvoegen. Bij het samenvoegen van de kolonies gebeurt, wordt de oppervlakte van deze kolonies beschouwd als de gemeenschappelijke ruimte. Figuur 5. Een representatief resultaat van de analyse van een plaat. (A) Een beeld van de output van de detectie verzoek aan het einde van het experiment. Elke kolonie wordt aangemerkt, gekleurd en krijgen een uniek ID-nummer. De pijlen wijzen naar representatieve kolonies gemeten B. De kolonie wordt gedetecteerd gebaseerd op intensiteitdrempel (voor E. coli kolonies op LB agar of M9 agar drempel is 0,03. Voor andere media of bacteriën, deze drempel kan worden aangepast in functie ProcessPictures ). Alleen objecten boven de 10 pixels geteld (deze drempel kan in de functie MatchColonies worden gewijzigd). Detectie van een kolonie begint bij ongeveer 10 5 bacteriën. (B) Plots van het gebied in pixels versus de tijd van vier representatieve kolonies in deze plaat. Met het uiterlijk 'bij elke kolonie is wanneer de kolonie wordt gedetecteerd. De 'groei' bij elke kolonie is hier gedefinieerd als de tijd om weer te groeienm 20 pixels naar 80 pixels (die grenzen zijn instelbaar met behulp van de functie getAppearanceGrowthByVec). De software sluit de kolonies die zijn gefuseerd vóór het bereiken van de bovengrens. Identificatie van specifieke kolonie volgens zijn eigenschappen is eenvoudig dankzij het identificatienummer en de kleur toegewezen aan elke kolonie. Bijvoorbeeld kolonies # 1, 56, 77 en 124 zijn gemarkeerd in beide grafieken. Figuur 6. Voorkomen kwantificering kan bimodale vertraging verdeling Vergelijking van ScanLag analyse histogrammen van verschijningstijdstippen voor twee verschillende stammen onthullen.. Blauwe lijn: wild-type stam groeit exponentieel (Totaal: 1.320 kolonies); rode lijn-hoge persistentie mutant verrijkt met achterblijvende bacteriën (Totaal: 1.529 kolonies). (A) Genormaliseerde verschijning histogrammen. De piekvan het verschijnen van exponentieel groeiende cellen is de typische tijd te groeien tot een detecteerbare kolonie. Inzet: zelfde histogram van de mutante stam na aftrek van het tijdstip van de piek van de exponentiële kweek de werkelijke vertraging voor-log afstand bakken die de bimodale verdeling te vertragingstijd. (B) overlevingsfunctie van dezelfde gegevens als in (A) op een logaritmische schaal. Deze representatie verbetert de late verschijning staart van de mutante stam. Figuur 7. Uiterlijk verspreiding en groei tijdsverdeling. (A) en (B) tonen tweedimensionale histogrammen van het uiterlijk tijd en de groeitijd van de twee verschillende condities (De software sluit kolonies samengevoegd alvorens de bovengrens). (C) Vergelijking van de histogrammenvan de twee stammen tonen het verschil in uiterlijk de tijd, terwijl de groei tijden (D) zijn vergelijkbaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 8. Het uiterlijk van vroege kolonies niet interfereert met het verschijnen van kolonies later. (A) vertragingstijd verspreiding van wildtype cellen alleen geplateerd. (B) vertragingstijd distributie van een koude gevoelige stam alleen, na overdracht naar permissieve temperatuur. (C) vertragingstijd distributie van beide stammen samen vergulde onder dezelfde voorwaarden. De zwarte lijn geeft de verwachte verdeling op basis van de verkregen bij het meten van elke stam afzonderlijk data. Een goede eengreement tussen de verwachte en gemeten verdelingen zolang het totale aantal kolonies per plaat onder 200 verkregen. .. Figuur 9 De drempelwaarde heeft geen invloed op de vorm van de kolonie verschijning distributie De kolonie verschijning distributie werd geanalyseerd op dezelfde dataset met behulp van twee verschillende drempel maten; (A) drempel is 10 pixels; (B) drempel grootte is 50 pixels. Aantal cellen per histogram: ca.. 1500. De verschillende detectiedrempel slechts leidt tot een verschuiving van de detectie tijd. Figuur 10. Temperatuurbestendigheid metingen across oppervlak van de scanner. (A) Afbeelding van een plaat met kolonies van Bacillus subtillis geteeld op de scanner zonder Power Management. Het oppervlak is warmer op de bodem en daardoor de kolonies groeien sneller. De geleidelijke lijn naast de plaat is een schematische weergave van de hittegradiënt. (B) De stabiliteit temperatuur werd gemeten met twee thermokoppels geplaatst over het oppervlak van de scanner. De scanner wordt tijdens elke scan en over de tijd. (C) Met Power Management, de temperatuur is uniform en de kolonies groeien in gelijke mate. (D) Zelfde als (B) met de module Power Management. Temperatuurstabiliteit van ± 0,2 ° C. Figuur 11. Verschillen in de verdeling uiterlijk kan worden veroorzaakt differences in de volumes vast medium. Dezelfde bacteriële kweek werd uitgeplaat op platen met verschillende volumes LB agar, wat resulteert in een verschillende hoogte agar oppervlak. De verschillende hoogtes leidde tot verschillende ondoorzichtigheid van de platen, en dus een andere detectie tijd. De inter platen verschil werd gecontroleerd en het verschil tussen verschillende hoogte omstandigheden. (A) typische verschillen tussen de platen van gelijke volumes van 30 ± 0,5 ml LB Agar. (B) Verschil tussen verschillende hoogte voorwaarden: de verschijning distributie werd gemeten voor borden met een inhoud van 20 ± 0,5 ml (rood), van 30 ± 0,5 ml (groen) en van 40 ± 0,5 ml (blauw). Elke toestand is het gemiddelde van 6 verschillende borden. Zolang het volume van de platen binnen ± 5 ml bereik, de opaciteit is vergelijkbaar en leidt tot soortgelijk uiterlijk tijdsverdeling.

Discussion

Microscopische methoden op basis van directe observatie worden vaak beschouwd als de "gouden standaard" voor het bestuderen van eencellige gedrag. ScanLag, die meting van de verdeling van Lag keer in bacteriële populaties maakt, levert gegevens in goede overeenstemming met de verdeling verkregen van single-cell analyse en bereikt veel hogere statistiek.

Een aantal cruciale stappen hebben voor deze methode worden uitgevoerd om goed te werken: eerst, geen compromis over de scanner resolutie, die 4800 x 9600 zou moeten zijn om goede beelden te krijgen. Ten tweede, zich ervan bewust dat zonder de power management module (stap 1.6), kan temperatuurgradiënt ontwikkelen op de flatbed oppervlak en beïnvloeden de groei. Een andere belangrijke stap is filtratie van defecten zoals stof die per vergissing kunnen zijn geteld als kolonies door de software. De ingebouwde achtergrond aftrek van de software overwint meestal deze gebreken, maar soms "valse" kolonies moetenhandmatig gefilterd.

De belangrijkste stappen voor probleemoplossing kunnen inter-plaat variatie aan te pakken in de setup, om verschillende redenen: (a) De groei van micro-organismen wordt beïnvloed door de temperatuur. Verschillende temperatuur en vochtigheidsgraad kunnen optreden als gevolg van ongelijke ventilatie of plaats van de schotel in de incubator. (B) De elektronica van de scanner warm kan veroorzaken en een temperatuurgradiënt over het oppervlak van de scanner. Figuur 10 toont de invloed van dergelijke ruimtelijke hittegradiënt over Bacillus bacteriën, samen met de metingen van de temperatuur op de scanner oppervlak voor en na de uitvoering van de power management module (stap 1.6). Merk op dat deze module niet noodzakelijk nieuwere scanners kunnen zijn, en slechts een deel van het oppervlak scanner wordt gebruikt, kan energiebeheer overbodig. (C) Platen met verschillende opaciteit van de nutriënt agar inderdaad tot verschillende detectieniveaus. Figuur 11 toont the tolerantie voor verschillende volumes van nutriënt agar die resulteren in verschillende opaciteit.

Experimenteel de ScanLag techniek is eenvoudig uit te voeren en vereist slechts micro-organismen plaat op standaard petrischalen, en ze op het oppervlak van de scanner. De software die is ontwikkeld regelt de gehele procedure. Het beeld overname gebeurt automatisch, en de beeldanalyse voor kolonie tracking is ook automatisch. Bovendien kan het systeem worden opgeschaald naar veel verschillende omstandigheden tegelijk meten. Tenslotte steunt de methode op commercieel kantoor scanners en daarom is lage kosten.

Deze techniek kan worden uitgebreid tot de studie van micro-organismen die verschillen van E. coli K-12, maar enkele overwegingen worden gemaakt. Ten eerste, de invloed van vroege kolonies verschijnen op de latere moet worden beoordeeld, zoals beschreven in een eerdere publicatie 7. E. Coli K-12, demaximale dichtheid van de CFU per plaat is 200. Andere stammen met verschillende maten van de kolonies, en andere mogelijke overspraak tussen kolonies, misschien een andere dichtheid vereisen. Ten tweede, is de analyse van de platen gekalibreerd om specifieke software drempelwaarden die mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van het contrast tussen de vast medium en de kolonies. De software kan ook worden uitgebreid tot extraheren andere kolonie kenmerken, buiten lag en groeisnelheid. De software code is open en kan worden aangepast aan kolonie vorm, helderheid, gladheid en kleur te extraheren.

Omdat de metingen zijn uitgevoerd bij kolonies die afkomstig zijn van enkele cellen, de gegevens blijkt nieuwe fenotypes die niet kan worden gemeten door de bevolking-niveau metingen. Het belang van de lag tijdsverdeling wordt geopenbaard in de aanwezigheid van antibiotica. Veel antibiotica is bekend om effectief te zijn alleen tegen groeiende cellen; dus zolang de cellen blijven in de aanloopfase en groeien niet, ze zijn probeschermd tegen de gevolgen van die antibiotica 21. Wanneer het aantal overlevende bacteriën worden geëvalueerd tijdsintervallen tijdens behandeling met antibiotica 15,22,23, wordt een subpopulatie van bacteriën, genaamd persisters vaak geopenbaard. In sommige gevallen immuniteit voor antibiotica afkomstig van langdurige vertraging. Met deze opstelling wordt deze vertraging geopenbaard en heeft vaak een niet-triviale verdeling 24 (figuur 6). Deze methode kan ook het terughalen van zeldzame mutanten. Bijvoorbeeld, na plating gemutageniseerde populatie mutanten kunnen worden geïdentificeerd op basis van fenotype en geïsoleerd rechtstreeks, zonder selectie. De opstelling kan ook cel-cel interacties controleren door meting van de groei van koloniën als functie van de dichtheid van nabijgelegen kolonies en fenomenen zoals quorum sensing of de verspreiding van bacteriën zwermen kwantificeren. Multidimensionale informatie ontdekt door toekomstige experimenten met behulp van deze methode zal leiden tot een betere karakterisering van microbiële populaties en de vooruitgang in de medische en milieu-onderzoek.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

Materials

Name of Material Company Catalog Number Comments/Description
Bacto Agar BD 214010
Difco LB broth BD 240230
Petri dish 90mm Miniplast 20090-01
Name of Equipment
Epson Perfection v37 Epson B11B207201 Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution: 4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.
Epson Perfection v200 Epson B11B188011
Epson Perfection 3490 Epson B11B177011
ADU200 USB Relay ONTRAK
pieces of sterile black felt cloth custon made approximatly 100 x100 mm
white plate holders custon made surface size, with 6 x 99mm diameter hole
Delerin rings the size of the Petri dish custon made inner diameter: 72 mm
outer diameter: 86 mm
top outer diameter: 90 mm
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Bochner, B. R. Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).
  2. Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).
  3. Penfold, W. J. On the Nature of Bacterial Lag. J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).
  4. Powell, E. O. Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture. J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).
  5. Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis. Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).
  6. Hertog, A., et al. Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies. PloS one. 5, (2010).
  7. Levin-Reisman, I., et al. Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes. Nature Methods. 7, (2010).
  8. Lewis, K. Persister cells. Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).
  9. Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics. Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).
  10. Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).
  11. Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells. Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).
  12. Pin, C., Baranyi, J. Single-cell and population lag times as a function of cell age. Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).
  13. Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).
  14. Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations. Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).
  15. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  16. Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner. Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).
  17. Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells. Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).
  18. Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).
  19. Ernebjerg, M., Kishony, R. Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking. Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).
  20. Rotem, E., et al. Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).
  21. Bigger, J. The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes. Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).
  22. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiol. 13, 25 (2013).
  23. Moyed, H. S., Bertrand, K. P. Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis. Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).
  24. Balaban, N. Q. Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 768-775 (2011).

Tags

Colony GrowthLag TimeGrowth DynamicsMicroorganismsHigh-throughputQuantificationScanLagAutomated ImagingColony DetectionGrowth RatePhenotypic Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Levin-Reisman, I., Fridman, O., Balaban, N. Q. ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time. J. Vis. Exp. (89), e51456, doi:10.3791/51456 (2014).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image