ScanLag：高通量的菌落生长定量和滞后时间问题

作为延迟时间的分布提取一个例子， 图5示出了识别和跟踪每个集落具有在一个板上的具体特征随着时间的推移，由于将在筛选测定来完成的ScanLag的能力。 当微生物的培养是异构的，不同的亚群可能在试验过程中显露出来。例如， 图6示出的外观量化，从而揭示了双峰滞后时间分布在大肠杆菌的突变株大肠杆菌。 细胞的生长速度影响菌落的出现时间。当菌落生长以同样的速度，出现较晚可以归因于滞后时间（ 图7）。 为了验证该方法确实测量单个细胞的滞后时间，我们比较ScanLag结果与使用单细胞显微镜获得的;这种验证是递减在以前的出版物7 ribed的细节。此方法使监测更多的细胞比用显微镜进行评估。使用显微镜和使用ScanLag取得所得的分布在很大程度上重叠。该ScanLag分布稍宽;理论分析预测扩大为划分时间的标准偏差的顺序。如果生长时间是不同的每个菌株，在外观上与延迟的来源必须进一步用其它方法影响。 的早期出现菌落后菌落外观的影响进行了研究。对照实验7确认后的外观没有影响，只要每个平板菌落的总数没有超过200（ 图8）。另一种控制实验证实，殖民地上盘的位置没有影响其出现的时间7。 的p的分析鲈被校准以取决于存在于生长培养基中或微生物的类型的营养物质，可能需要修改特定的阈值。然而，该分析是相当健壮的大范围的阈值， 如图所示9。 图1：创建一个殖民地的外观分布所需的步骤示意图。 图2的屏幕抓图设备管理器中显示的扫描仪附带的配置文件，以及姓名。 请点击此处查看大图版本这个数字。 图3的屏幕抓图扫描经理。 图4，屏幕截图ScanLagApp的。板的图像是在左边窗格中，每个菌落的生长曲线在右窗格中，如手册中详细说明。当两个或多个菌落合并在一些菌落面积曲线的尖峰出现。当殖民地合并发生时，这些殖民地的面积被认为是联合区。 图5。1板的分析的代表性结果：（A）的检测应用在实验结束时，输出的图像。每一集落区域被识别，彩色和分配有一个唯一的ID号。箭头指向B.测量基于强度阈值检测菌落（代表菌落在LB琼脂或M9琼脂大肠杆菌菌落这个阈值是0.03，其他媒体或细菌，这种阈值可以在函数ProcessPictures调整）。上述10个像素只有对象计数（此阈值可以在函数MatchColonies进行修改）。检测殖民地开始于大约10 5细菌。 （B）图解中的像素与在该板4代表菌落时间的区域。各殖民地的“演出时间”是在检测到殖民地时。每个菌落的'成长时间“在这里定义为在时间来回成长米20个像素至80像素（这些边界是可调节的使用功能getAppearanceGrowthByVec）。该软件不包括在达到上限之前合并的殖民地。特定菌落根据其特征识别是容易由于该识别号码和分配给每个集落的颜色。例如菌落＃1，56，77和124的两个图形突出。 图6。外观量化可以发现双峰滞后时间分布的出现的次数为两个不同的菌株ScanLag分析直方图的比较。蓝线：野生型​​菌株成倍增长（总计：1,320殖民地）;红线 – 高持久性突变富含落后菌（共1,529殖民地）。 （ 一 ）归一化的外观直方图。高峰外观呈指数生长的细胞中是典型的时间长到可检测的菌落。插图：减去指数文化高峰的时间来获得实际的滞后时间对数间隔箱显示双峰滞后时间分配后的突变株相同的直方图。 （ 二）对数刻度的相同的数据（A）的生存功能。这种表示增强了突变株的后期外观尾巴。 图7。外观分布和生长时间的分布（A）和（B）表示的外观时二维直方图和在两种不同的条件（该软件不包括菌落到达上限之前合并）的生长时间。 （c）比较直方图两个菌株的显示出现的时间差异，而生长时间（D）是相似的。 请点击这里查看这个数字的放大版本。 图8。早期殖民地的外观不会干扰以后的菌落的外观。（一 ）单独滞后镀野生型细胞的时间分布。 （二）单独滞后感冒敏感菌株的时间分布，转移到允许的温度后。 （C） 的滞后相同的条件下电镀一起两种菌株的时间分布。黑线表示基于分别测量各应变时所获得的数据的预期分布。一个好一个只要每个平板菌落的总数是200以下，获得预期的和测量的分布之间greement。 。图9中的检测阈值不影响菌落外观分布的形状的菌落外观分布为使用两个不同的阈值的大小相同的数据集进行分析; （ 一 ）阈值大小为10像素; （B）阈值大小为50像素。每个直方图细胞数：约。 1500元。不同的检测阈值的效果只有在检测时间的转变。 图10。温度稳定性的测量ACR一盘用生长在无电源管理扫描器枯草芽孢杆菌菌落OSS扫描仪的表面。（A）图片。表面上的底变暖，因此，菌落生长得更快。板旁边的渐进线是热梯度的示意性表示。 （B）的温度稳定性的测定使用两个热电偶放置在扫描仪的表面。扫描仪在每次扫描过程中，并随时间不断升温。 （c）与电源管理，温度均匀，菌落生长在类似的速度。 （ 四）同（B）与电源管理模块。为±0.2°C的温度稳定性 图11。在外观上分布的差异，可能是由于二fferences在固体培养基的体积。相同的细菌的培养物铺于不同体积的LB琼脂，造成琼脂​​表面的不同高度。的不同高度导致了不同的不透明度的板，因此，不同的检测时间。间板差异被检查和高度不同条件之间的差异。 30±0.5毫升LB培养基琼脂等体积的板之间（A）典型的差异。不同高度条件之间（B）差异：外观分布进行了测定和40±0.5毫升（蓝色）30±0.5毫升（绿色）用于板与20±0.5毫升（红色）卷。每个条件是6个不同的板的平均值。只要板的体积是在±5毫升不等，不透明度是相似的，导致类似的外观的时间分布。